木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain，简称CHP)是未成熟番木瓜中大量存在的一种半胱氨酸蛋白酶，具有较强的凝乳和蛋白水解能力。木瓜凝乳蛋白酶可以用于Rh血型鉴定、肿瘤的辅助治疗、治疗腰椎间盘突出症、消炎、细胞分离以及啤酒的澄清和奶酪的制造等，在工业上有广泛的应用。目前使用的木瓜凝乳蛋白酶都提取自天然的番木瓜中。由于番木瓜的乳汁中含有的其他半胱氨酸蛋白酶跟木瓜凝乳蛋白酶具有相似的结构和性质，因此给生产高纯度的产品造成了较大的困难。为了实现高纯度木瓜凝乳蛋白酶的生产，本文采用毕赤酵母和大肠杆菌对木瓜凝乳蛋白酶进行外源表达的研究，并获得初步表达。 本实验首先从未成熟番木瓜的果肉中提取全mRNA，通过RT-PCR克隆出木瓜凝乳蛋白酶基因后，分别将扩增产物和空载体pPICZa双酶切后进行连接，转化感受态大肠杆菌，筛选鉴定后送测序。RT-PCR结果表明扩增出预期大小的DNA片断，测序结果确认为目的片断，且插入位置正确。提取构建好的质粒pPICZa-CP并进行单酶切线性化，然后采取电转化的方法将其转进毕赤酵母GS115中，经Zeocin平板筛选和PCR鉴定后获得目的转化子。最后进行甲醇诱导发酵表达。SDS-PAGE与Western-Blotting结果表明木瓜凝乳蛋白酶在酵母中的表达不理想。 因此重新设计引物以pPICZa-CP为模板扩增出目的基因，分别对PCR产物和pET-22-b(+)进行双酶切，转进感受态大肠杆菌Top10中，经Amp平板筛选和PCR鉴定后测序，结果证实载体pET-CHP构建成功。提取pET-CHP质粒转进感受态大肠杆菌BL21中，进行Amp筛选和PCR鉴定后，挑选阳性克隆进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE与Western-Blotting结果表明木瓜凝乳蛋白酶在大肠杆菌获得表达。 本论文对木瓜凝乳蛋白酶进行了克隆表达的研究，为木瓜凝乳蛋白酶的工业生产制备奠定了基础。