蔗糖是植物和蓝细菌中光合作用的主要产物之一,蔗糖的降解为植物的生长、发育和应激反应提供碳源、能源或者信号分子。此外,蔗糖也在蓝细菌的应激反应、糖原合成和固氮等过程中充当重要的碳源载体。蔗糖酶(invertase)将蔗糖不可逆水解为葡萄糖和果糖,蔗糖的降解也可以由蔗糖合酶催化的可逆反应完成。蔗糖合酶主要参与贮存和结构多糖的生物合成以及植物库强度的调节,而蔗糖酶在初级碳代谢、生长和发育调控等多方面具有重要作用。根据最适酶促反应pH值,蔗糖酶可分为酸性蔗糖酶和碱性/中性蔗糖酶两大类。两者之间没有序列同源性,并且在细胞定位、底物特异性和物种分布等方面也具有较大差异。相比于已被广泛研究的酸性蔗糖酶,碱性/中性蔗糖酶的结构和催化机制研究一直是空白。鱼腥蓝细菌Anabaena sp.PCC 7120编码两个碱性/中性蔗糖酶InvA和InvB。文献报道表明现代植物中的碱性/中性蔗糖酶很有可能起源于蓝细菌。因此,我们对鱼腥蓝细菌的碱性/中性蔗糖酶InvA和InvB进行了深入研究。我们解析了 InvA和InvB及其与不同小分子的复合物的晶体结构,代表着第一个碱性/中性蔗糖酶的三维结构,同时也是糖基水解酶GH100家族的第一个结构。InvA和InvB分别以六体和二体形式存在。InvA和InvB单体的结构同源性非常高,整体由(α/α)6桶状的核心区和插入部分组成,这与酸性蔗糖酶的全β结构完全不同。复合物结构显示活性口袋的-1和+1位分别特异性结合葡萄糖和果糖。通过结构分析并结合突变实验,我们鉴定出了催化残基,即InvA的Asp188和Glu414以及InvB的Asp189,和Glu415,并且推测了碱性/中性蔗糖酶的催化机制。结构显示InvA具有一个相对狭小封闭的底物结合口袋,并且与一个蔗糖分子完美地契合,活性实验也表明InvA只水解蔗糖,因此阐明了 InvA及其同源碱性/中性蔗糖酶对蔗糖具有严苛底物特异性的结构基础。通过与其它糖基水解酶的比较,我们提出了碱性/中性蔗糖酶代表一类新型的葡萄糖苷酶,而非之前报道的β-呋喃果糖苷酶。酶学研究表明,异形胞中特异性表达的InvB比InvA具有更高的催化活性,虽然它们具有相似的最适反应pH和单体结构。结构比对结合活性实验表明,采取不同构象的Arg430对InvB的活性至关重要。并且提出InvB更高的催化活性可能是异形胞分化和固氮所需。此外,进化分析使得我们将碱性/中性蔗糖酶的物种分布推广到变形菌,并对其起源提供了可能的线索。Aerolysin家族是一大类β穿孔蛋白,相比于原核aerolysins,脊椎动物成员的结构和穿孔机制还不清楚。我们实验室的前期研究得到了斑马鱼aerolysin类穿孔蛋白Aep1(之前称为Dln1)的水溶性二体晶体结构和跨膜八体的低分辨率电镜结构,并证明脂质、甘露聚糖和低pH值促进Aepl寡聚化。我们期望通过单颗粒冷冻电镜技术解析高分辨率的Aep1八体结构,以阐明其穿孔机制。通过将Aep1二体蛋白插到酵母原生质体上形成穿孔的八体,然后用33种去垢剂溶膜的体系,我们成功筛选到了几种去垢剂可以溶解Aep1八体,结合负染电镜结果,最终选择LDAO。通过制备及纯化方法的优化,得到的样品在冷冻电镜下能找到一些八体颗粒。此外,我们通过结构分析并结合之前的糖芯片筛选结果,推测Aep1的天然受体可能是高甘露糖型N-糖链。然后通过多聚实验和ELISA验证了 Aep1对Man8NAG2的结合。最后,我们得到了 Aep1与Man8NAG2复合物的晶体结构,确定了其中三个甘露糖基的位置以及糖链延伸的方向。