Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV－1）是引起艾滋病全球性流行的主要病原体，HIV感染已成为威胁人类健康及社会发展的主要问题之一。P24壳体蛋白（capsid，CA）是HIV-1早期感染的一个重要标志， CA的N-末端与少至4个基质蛋白（Matric，MA）的氨基酸残基结合可以形成球状颗粒结构，这种球状结构有利于病毒样颗粒（Virus like particles，VLPs）结构和功能的形成。动物及Ⅰ期临床实验均已证实，HIV CA VLPs疫苗能够引起机体产生体液和细胞免疫应答。 植物表达系统属于真核细胞表达系统，利用植物生产重组蛋白具有很多优点，包括：降低携带动物性病原体的危险性、易于纯化、不需特殊的运输和储藏条件、植物培养基价格低廉降低生产成本、能进行正确的转译后修饰加工使产生的外源蛋白具有生物学活性及形成多聚体等，因此被认为是一个比微生物或动物更理想的蛋白生产系统。目前为止，已在转基因植物中成功表达了抗体、抗原疫苗、酶、酶抑制剂、细胞因子、凝血因子和激素等物质。 转基因植物作为生物反应器表达重组蛋白安全、经济和有效，但是重组蛋白在植物中表达量非常低，仅占可溶性总蛋白的0．01％～0．4％。尽管从基因转录和翻译水平等环节进行了条件优化，但是蛋白降解依旧是影响植物系统表达外源重组蛋白含量的重要因素。近年来利用植物悬浮细胞生产重组蛋白引起了人们的关注，植物细胞悬浮培养无需支持物，可以大规模培养，而且培养条件可以人工调控，从而为生产高产量的重组蛋白奠定基础。真核细胞内大部分蛋白质的降解是通过泛素－蛋白酶体途径，研究表明抑制蛋白酶体的活性可以提高细胞中蛋白的含量。在细胞内转入含有糜蛋白酶和胰蛋白酶样抑制位点的丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅱ基因使转基因水稻悬浮细胞的蛋白酶活性降低23％，重组蛋白人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的含量提高了2倍；将广谱抑制剂组织蛋白酶D基因导入马铃薯，外源基因表达产物TSP的产量提高20％-35％。 本课题组已将源于水稻的一个富含甘氨酸序列的信号肽（GRP）连接在MA4-CA融合基因的3’端，并将该融合基因转入到枸杞中，成功地建立了表达MA4-CA重组蛋白的转基因植株及根分泌表达系统。在此基础上，本研究旨在利用转基因枸杞愈伤组织建立悬浮细胞表达重组蛋白系统，并通过一系列浓度的特异性蛋白酶体抑制剂MG115作用于转基因枸杞悬浮细胞，探讨有效提高外源重组蛋白HIV-1 CA的可行性。 研究目的： 利用本实验室构建的分泌型植物表达载体，通过根癌农杆菌对枸杞进行遗传转化，建立转基因枸杞的再生植株表达系统和悬浮细胞表达系统。在分析发现转基因枸杞蛋白酶体活性增强的基础上，通过蛋白酶体抑制剂MG115对悬浮细胞蛋白酶体活性的作用探讨抑制剂对转基因枸杞悬浮细胞重组HIV-1壳体蛋白含量的影响，为进一步研究植物HIV-1 CA VLPs疫苗及今后大量生产高纯度的重组蛋白奠定基础。 研究方法： （1）转基因枸杞再生植株及悬浮细胞系的建立：应用MS培养基为基本培养基，利用不同激素配比进行枸杞愈伤诱导，分化诱导，利用愈伤组织筛选稳定的表达重组蛋白CA的悬浮细胞系统。 （2）表达重组HIV壳体蛋白转基因枸杞悬浮细胞的鉴定：提取枸杞悬浮细胞基因组DNA，PCR扩增分析转基因植株内的目的基因；ELISA、Western blot及免疫组织化学方法鉴定转基因枸杞中HIV CA的表达。 （3）转基因枸杞悬浮细胞表达HIV CA含量的研究：选取生长良好的枸杞悬浮细胞，分别加入一系列浓度的抑制剂MG115共培养，荧光底物法检测悬浮细胞蛋白酶体活性的变化，ELISA、Western blot及免疫组织化学方法观察细胞内HIV壳体蛋白含量的变化。 研究结果： （1）应用MS培养基为基本培养基，利用6－BA、NAA、2，4－D和KT成功地进行了枸杞的愈伤、再生芽及根系诱导，并利用愈伤组织建立了转基因枸杞的悬浮细胞表达重组蛋白CA系统。 （2）PCR结果显示MA4－CA融合基因成功导入枸杞中；Western blot证实转基因枸杞中的MA4－CA融合蛋白以约55kDa存在：经N－糖苷酶处理后，Western blot在37kDa和26kDa检测到各有一条带，说明转基因枸杞悬浮细胞表达的CA为其糖基化形式。 （3）适宜浓度的MG115可以显著性抑制蛋白酶体活性，ELISA、Western blot及免疫组织化学方法检测到50μM和100μM的MG115能有效提高转基因枸杞悬浮细胞中HIV壳体蛋白的含量。 结论： 利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化枸杞，成功地对转基因植株进行了分化诱导，并利用获得抗性愈伤组织建立了稳定表达HIV CA的转基因枸杞悬浮细胞系统。PCR结果表明MA4-CA融合基因已经导入枸杞基因组中：Western blot表明CA以分子量55KDa左右存在于枸杞中，糖苷酶处理蛋白证实枸杞悬浮细胞表达的CA以糖基化形式存在；免疫组织化学实验表明MA4-CA主要分布于细胞壁和细胞膜。荧光底物法测定枸杞蛋白酶体活性发现转基因枸杞细胞蛋白酶体的活性为正常枸杞的4．2倍。ELISA、Western blot和immunohistolchemisty结果表明，50μM和100μM蛋白酶体抑制MG115可有效地提高转基因枸杞悬浮细胞中HIV壳体蛋白的含量。