Visfatin/Nampt是一个比较复杂的蛋白。它既被发现是哺乳动物NAD合成的限速酶,又被发现是一种主要由内脏脂肪分泌的脂肪细胞因子,具有广泛的生物学功能。首先,它控制着NAD的合成,极大地调控了生物体的各种生物学功能。另外,它还能促进细胞增殖、参与炎性应答、调节细胞分化、抗细胞凋亡、参与细胞周期,调控胰岛素分泌等等。临床研究发现,Nampt/visfatin/PBEF与多种临床疾病密切相关,如1型糖尿病、2型糖尿病、急性肺部炎症和败血症、类风湿性关节炎、肥胖和脂代谢异常、胰岛素抵抗和代谢综合征、妊娠和分娩、妊娠期糖尿病、肾病、铁代谢异常等等。在各种文章中,visfatin/ Nampt/PBEF这三个名字均有应用,造成了一定的混乱。Visfatin最为常用,而Nampt被HUGO基因命名法委员会和小鼠基因命名法委员会共同确认为官方命名。因此,在本文中,将一直使用visfatin/Nampt。Visfatin/Nampt的在各种组织内均有表达,这种广泛表达性预示着其多功能性。国际上对于visfatin/Nampt在心血管系统中的作用,比如对内皮细胞的增殖,在动脉粥样硬化斑块中的作用等已经有一些报道[1-3]。但是,并没有任何关于visfatin/Nampt的直接对于血管活性是否有调节作用的报道。本课题针对visfatin/Nampt在心血管系统的作用,尤其是血管外膜脂肪和血管中层平滑肌的旁分泌作用、visfatin/Nampt在8种心血管病理动物模型上的表达变化以及visfatin/Nampt对缺血性脑卒中的保护作用,进行了详细的研究。并在此基础上,着重探讨了visfatin/Nampt促VSMC增殖和visfatin/Nampt的神经保护作用的机制。最后提出了visfatin/Nampt在PVAT和血管中层VSMC间的旁分泌作用机制和visfatin/Nampt通过LKB1-AMPK-mTOR通路发挥神经保护作用的机制。具体实验如下:第一部分:在第一部分的工作中,我们主要对visfatin/Nampt在心血管系统的生理活性和功能进行探讨。我们的实验结果显示:visfatin/Nampt本身并没有血管收缩或舒张作用,不参与对血管的张力调节。血管外膜脂肪(PVAT)高表达并且可以分泌visfatin/Nampt,而PVAT分泌出来的visfatin/Nampt可以通过旁分泌作用于与血管外膜脂肪邻近的血管中膜平滑肌细胞层,并通过NMN依赖的、ERK1/2和p38介导的机制促进VSMC的增殖过程。此现象的阐明对血管生物学以及动脉粥样硬化的发生发展,肥胖、糖尿病的发病机制研究及治疗都具有一定的作用。实验一:利用Real-Time PCR和Western blotting技术,我们在mRNA和蛋白两个水平证实visfatin/Nampt在PVAT上高表达,而且表达量比内脏脂肪还要高。另外,和大鼠类似,visfatin/Nampt在猴的PVAT上高表达,超过内脏脂肪表达量。而在浓缩的PVAT孵育液中,我们探测到了visfatin/Nampt,浓度和血清visfatin/Nampt相当。这说明血管外膜脂肪是高表达并且可以分泌visfatin/Nampt的。实验二:Vsfatin/Nampt不影响血管收缩和舒张功能,也不影响PVAT的抗血管收缩功能。直接加入累积剂量(0.0001–10 nM)的visfatin/Nampt重组蛋白不影响血管的收缩和舒张功能。而且,无论是使用visfatin/Nampt特异性的抗体,还是用visfatin/Nampt特异性抑制剂FK866,都对PVAT的抗血管收缩作用无影响。因此,否定了visfatin/Nampt有直接的血管活性的可能性。实验三:我们利用BrdU摄入法、CCK-8法、直接在血细胞计数板下计数法、Ki-67法这4种方法均发现,visfatin/Nampt可以剂量、时间依赖性地促进VSMC的增殖。visfatin/Nampt特异性抑制剂FK866和visfatin/Nampt特异性的抗体都可以阻断visfatin/Nampt对促VSMC增殖作用。实验四:外源性visfatin/Namp(t1 nM)对正常培养条件下的VSMC凋亡没有影响,但对双氧水导致的VSMC凋亡有明显的拮抗作用。实验五:使用Western blotting技术考察h-Caldesmon和Smooth myosin heavy chain的表达来探讨外源性visfatin/Nampt对VSMC的分化的作用。我们对不同浓度(0.1、1、10 nM)和不同时间(1、2、4天)的visfatin/Nampt进行了考察。结果发现,外源性visfatin/Nampt对VSMC的分化没有影响。实验六:使用ERK1/2, p38, JNK, PI3K/Akt四条信号通路的抑制剂U0126, SB203580, SP600125, LY294002对visfatin/Nampt促VSMC增殖过程进行干预。结果显示ERK1/2和p38信号通路参与了visfatin/Nampt的促VSMC增殖作用。在visfatin/Nampt (1 nM)加入5,10,15分钟后,可以明显的增加ERK1/2和p38的磷酸化。并且,随着剂量的上升,visfatin/Nampt对ERK1/2和p38的磷酸化作用逐渐加强。visfatin/Nampt不能激活JNK和Akt通路。实验七:利用RNA干扰技术knockdown胰岛素受体(IR)后,不能阻断visfatin/Nampt对VSMC的增殖作用,也不能影响visfatin/Nampt对ERK1/2和p38信号通路的激活。而且,直接从尾静脉注射重组visfatin/Nampt也不能降低ICR小鼠的血糖水平。因此,我们认为visfatin/Nampt促VSMC增殖的作用不是IR介导的。实验八:利用HPLC+质谱测定NMN发现外源性NMN可以模拟visfatin/Nampt的促VSMC增殖作用,和对ERK1/2和p38的磷酸化作用。第二部分:在这部分的研究中,我们制备了8种不同的心血管病理生理动物模型,包括高血压、易卒中性高血压、糖尿病、AS、老年、肥胖、限食、尼古丁给药模型。我们希望在这些动物模型的不同脂肪上发现visfatin/Nampt的表达变化,从而为下一步探讨visfatin/Nampt在相应的疾病中的病理学机制打下基础。同时,我们测定了血清中visfatin/Nampt浓度和血清学基本指标,旨在探索血清visfatin/Nampt和局部脂肪的visfatin/Nampt在这些病理生理状态改变的情况下是如何改变的。实验一:我们测定了8种病理生理大鼠模型的各部位脂肪的重量,以及和体重标准化后的重量。这些数据显示了8种病理生理模型的各部位脂肪有着不同程度的改变。实验二:我们对8种病理生理大鼠模型的血清学基本指标进行了测定。包括血清葡萄糖,血清甘油三酯,血清总胆固醇,血清高密度胆固醇,血清低密度胆固醇,血清胰岛素。这8种病理生理模型的血清学指标均有不同程度的改变。实验三:对8种病理生理大鼠模型的血清visfatin/Nampt浓度测定。发现只有LH大鼠血清visfatin/Nampt升高,其他模型的血清visfatin/Nampt全部没有显著变化。实验四:使用Western blotting测定8种病理生理大鼠模型各部位脂肪visfatin/Nampt表达量。发现内脏脂肪和PVAT的visfatin/Nampt表达量变化受代谢影响较大,而皮下脂肪则不容易受到改变。第三部分:考虑到visfatin/Nampt是一个极为重要的酶,控制着NAD的合成速率,并且,在第一部分的工作中,我们也已经发现visfatin/Nampt能够抑制VSMC的凋亡。因此,我们猜测visfatin/Nampt和脑卒中有一定的关系。在这部分的工作里,我们通过多种实验手段,如免疫荧光,TUNEL法,Annexin+PI法,Western blotting,慢病毒介导的overexpression/knockdown等,证明了visfatin/Nampt是一个在脑卒中的生理病理过程中有着重要作用的神经保护因子,在缺血性脑卒中的情况下可以保护脑组织,减少脑梗死的面积。实验一:我们首先确认了visfatin/Nampt在脑组织中有表达。随后,在原代培养的神经元细胞上,我们发现在神经元上有visfatin/Nampt表达。实验二:使用FK866长期给药抑制visfatin/Nampt可加速SHR-SP的死亡;MCAO后24小时,梗死区和半影区的visfatin/Nampt表达上调; OGD也可以使神经元细胞上的visfatin/Nampt表达上调。预示visfatin/Nampt可能有神经保护作用。实验三:抑制visfatin/Nampt扩大MCAO模型脑梗死范围,可被visfatin/Nampt产物NMN逆转。提示visfatin/Nampt可能有神经保护作用。实验四:抑制visfatin/Nampt加重MCAO模型神经细胞凋亡。提示visfatin/Nampt可能有神经保护作用。实验五:给予LV-Nampt,在大鼠脑局部过表达visfatin/Nampt后,可以降低MCAO模型的梗死面积和神经细胞凋亡。并且,在离体培养的神经元细胞上,LV-Nampt抑制神经细胞死亡、凋亡,能够使得神经元细胞在缺氧缺糖的刺激下更容易存活。其具体的分子生物学机制仍在深入探讨。第四部分:这部分的研究结果首次证明了PTU导致的VSMC凋亡在甲状腺功能低下状态容易发生动脉粥样硬化中的机制中发挥了重要作用。实验一:首先,抗甲状腺药物PTU能够促进AS的发展。在我们的研究中,高脂+PTU饮食6周即可诱导大鼠主动脉病变,产生典型的AS斑块。预示PTU有单独的促AS发生的作用。实验二:在HC+PTU饮食的大鼠早期血管内皮功能障碍并不存在。在HC+PTU或单用PTU的大鼠的血管上,早期并没有出现内皮功能损害。实验三:在HC+PTU和单用PTU饮食的大鼠发现主动脉平滑肌细胞早期即可出现凋亡。而且,通过TUNEL和Western blotting,我们发现:PTU导致的T3/T4浓度下降在VSMC的凋亡中可能扮演了重要角色。结论:在本论文中,通过visfatin/Nampt在生理学、病理生理学状态下的意义的研究以及对缺血性脑卒中的影响的研究,我们证明了以下两点:一、visfatin/Nampt没有直接血管收缩舒张作用,但是可以通过NMN依赖的、ERK1/2和p38介导的作用促进VSMC增殖,并且此作用不涉及IR。二、visfatin/Nampt在缺血性脑卒中的发生过程中是一个重要的神经保护因子。