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背景和目的矽肺是由于长期吸入含SiO2粉尘所致的以肺间质纤维化为主的疾病,其发生发展机制虽未完全阐明,但已知肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞是其关键环节之一。大量研究表明,细胞表型变化的实质可能是以转录因子(Transcription factors,TFs)为主所介导的基因选择性表达。目前,矽肺发病中成纤维细胞转分化的关键TFs及其调控效应尚不清楚。因此,构建SiO2粉尘刺激巨噬细胞及肺成纤维细胞共培养模型,观察肺成纤维细胞转分化过程,通过转录组学测序和生物信息学分析筛选其关键TFs,并对筛选出的主要TFs在小鼠矽肺不同阶段的表达水平进行检测,探索其与肺成纤维细胞转分化的关联性,以期为深入研究矽肺发病机制提供参考资料。方法1.SiO2粉尘诱导成纤维细胞转分化关键转录因子筛选及初步验证1.1 SiO2诱导体外成纤维细胞转分化模型建立和观察小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3细胞)和小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)常规培养。综合CCK-8实验确定的SiO2对RAW264.7的细胞毒性结果和ELISA实验确定的SiO2刺激RAW264.7产生TGF-β1的浓度结果,确定最佳染尘浓度;通过Transwell构建NIH/3T3细胞和RAW264.7细胞的体外转分化共培养模型,实验分为空白对照组、SiO2染毒组和10 ng/mLTGF-β1阳性对照组,采用qPCR和Western Blot方法检测SiO2刺激前后转分化标志α-SMA、COL1A1和FN1的表达情况。1.2成纤维细胞转分化过程关键转录因子筛选利用转录组测序技术检测各组转分化前后基因表达情况,GO和KEGG数据库进行功能注释。在GEO数据库下载和分析TGF-β1直接刺激人胚肺成纤维细胞IMR-90、人胚肺成纤维细胞MRC-5和健康成人原代肺成纤维细胞的高通量数据。将上述结果与AnimalTFDB数据库收录的TFs序列进行比对,筛选出成纤维细胞转分化相关的关键TFs。qPCR方法检测SiO2和TGF-β1刺激成纤维细胞转分化前后这些关键TFs表达情况,并对筛选出的关键TFs再次进行功能注释找出它们共同参与的生物学过程和相关信号通路。1.3 PPARγ/LXRα轴对成纤维细胞转分化的影响对筛选出的关键TFs之一的NR1H3(LXRα)进行表达干预,将siR-LXRα和LXRα过表达质粒分别单独转染到SiO2和TGF-β1诱导的体外转分化共培养模型中,qPCR和Western Blot方法检测SiO2和TGF-β1刺激转分化前后α-SMA、COL1A1、FN1及LXRα表达水平。双荧光素酶基因报告检测LXRα对α-SMA启动子区域的活性的影响。CCK-8实验确定LXRα上游另一关键TF PPARG(PPARy)激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)的最佳作用浓度,将RSG加入到SiO2和TGF-β1诱导的体外转分化共培养模型中,qPCR方法检测SiO2和TGF-β1刺激成纤维细胞转分化前后α-SMA、COL1A1及LXRα表达水平。2.PPARγ/LXRα轴在实验性矽肺发生发展中的表达水平时序检测将100只雄性C57小鼠随机均等分配至生理盐水组和SiO2处理组,于非暴露气管滴注染尘法造模后1天、7天、14天、28天和56天收集各组小鼠的肺组织,HE和Masson染色观察肺组织在不同染尘时段的形态、炎症浸润和胶原沉积情况,qPCR和免疫荧光检测α-SMA、COL1A1和VIM表达水平并鉴定小鼠矽肺模型,观察LXRα和PPARγ在实验性矽肺发生发展中的不同时段表达水平。3.统计学分析用SPSS 21.0对实验数据进行统计学分析。若数据符合正态分布,则结果用均数±标准差(x±s)表示,Student’s t检验检测两组独立样本间的均数比较,单因素方差分析检测多组间均数差异比较,检验水准α=0.05。结果1.SiO2粉尘诱导成纤维细胞转分化关键转录因子筛选及初步验证1.1 SiO2诱导体外成纤维细胞转分化模型建立和观察随着SiO2染尘浓度逐渐增高,RAW264.7细胞存活率不断降低。与0～75μg/mL各组相比,100 μg/mL组开始出现明显的细胞毒性(P<0.05)。与0～75 μg/mL各组和125 μg/mL组相比,100 μg/mL组细胞上清中的TGF-β1浓度在染尘后24、48和72小时均为最高(P<0.05)。因此,该浓度作为转分化模型构建的染尘浓度。与对照组相比,在共培养染尘24小时后α-SMA和FN1表达明显升高(P<0.05),染尘48和72小时后COL1A1表达增高(P<0.05);TGF-β1刺激后24、48和72小时后α-SMA、COL1A1和FN1表达均明显升高(P<0.05)。1.2成纤维细胞转分化过程关键转录因子筛选TGF-β1分别刺激IMR-90、MRC-5、NIH/3T3和人肺原代成纤维细胞转分化后,有48个共同上调的基因和25个共同下调的基因,与TFs序列比对后筛选出上调的关键TFs为EGR2和BHLHE40,下调的关键TFs为TBX2、NR1H3、NR2F1、PPARG和EPAS1。qPCR检测发现这些TFs的变化与测序结果一致(P<0.05)。对7个关键TFs功能富集后发现其主要参与转录调控过程及通过PPAR信号通路中的PPARγ/LXRα轴参与影响成纤维细胞转分化。1.3 PPARγ/LXRα轴对成纤维细胞转分化的影响与转染siR-NC相比,转染siR-LXRα可明显下调细胞内LXRα的表达水平(P<0.05),在SiO2及TGF-β1刺激后,α-SMA和COL1A1的表达均明显增高(P<0.05)。与转染空质粒组相比,转染LXRα过表达质粒可显著上调细胞内LXRα的表达水平(P<0.05),在SiO2刺激后,α-SMA未出现明显变化,COL1A1的表达明显增高(P<0.05);TGF-β1刺激后,α-SMA和COL1A1的表达均明显增高(P<0.05)。双荧光素酶基因报告结果表明,Actα2-WT+LXRα-NC组与Acta2-NC+LXRα-NC组相比相对荧光报告比值明显增加(P<0.05);Acta2-WT+LXRα组与Acta2-WT+LXRα-NC组相比相对荧光报告比值明显降低(P<0.05);Acta2-WT+LXRα组与Acta2-Mut+LXRα组相比相对荧光报告比值降低(P<0.05)。与DMSO溶剂对照组相比,30 μmol/L RSG开始对NIH/3T3具有明显抑制作用,因此选此浓度作为后续给药浓度。给药RSG后,与未处理组相比,SiO2或TGF-β1刺激后LXRα均出现明显降低(P<0.05),而α-SMA未出现明显变化;给药RSG的各组与加入DMSO溶剂对照的各组相比,LXRα均出现明显升高(P<0.05),而α-SMA表达均出现降低(P<0.05)。2.PPARγ/LXRα轴在实验性矽肺发生发展中的表达水平时序检测染尘7天后小鼠肺泡壁出现增粗和变宽,炎症浸润增加;28天时炎症浸润程度达到最高,肺泡腔内胶原纤维沉积明显增多,出现明显的细胞性结节;56天时细胞性结节增多且出现多区域纤维沉积密集灶,但未出现明显的纤维性结节。染尘1、7、14和28天α-SMA未出现明显增高,染尘56天时小鼠肺组织α-SMA、VIM和FN1表达量明显增高(P<0.05),染尘14、28和56天后小鼠肺组织COL1A1表达量均明显增高(P<0.05),染尘后1天和7天小鼠肺组织PPARy未出现明显变化,但染尘14、28和56天小鼠肺组织PPARy均明显降低(P<0.05),染尘后1、14天和56天小鼠肺组织LXRα均出现明显下降(P<0.05),但染尘7天和28天时未出现明显差异。结论多种TFs参与调控SiO2粉尘致肺成纤维细胞转分化过程,其中PPARγ/LXRα轴在矽肺纤维化中呈低表达趋势,是潜在的干预靶点。