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丰城鸡血藤（Callerya nitida var.hirsutissima Z.Wei）为一种传统中药。生长于江西、福建、湖南、广东、广西等地的山坡旷野或灌丛中。其性味微甘、苦、温,能行气活血,具有活血补血、舒经活络之功效,可有效解决气滞血瘀使气血畅通。为探究丰城鸡血藤及其活性化合物抗乳腺癌的药效作用机制,更好的服务于临床,本课题进行了以下研究。目的:通过网络药理学以及分子对接技术筛选出活性化合物可能作用的靶点,并结合体外药效作用机制研究,阐明其在体外分子层面的作用机制,并运用代谢组学策略探寻与丰城鸡血藤治疗乳腺癌相关的潜在生物标志物以及有关的代谢途径。方法:1、通过网络药理学筛选出丰城鸡血藤抗乳腺癌的潜在活性化合物以及作用靶点,建立丰城鸡血藤、潜在活性化合物、乳腺癌、靶点这四者的网络模型图,并预测其可能的作用机制以及结合位点,通过结合能的大小表征受体和配体的结合潜力。2、基于网络药理学以及分子对接结果进行体外药效作用机制研究。通过培养三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系,采用CCK-8实验进行吸光度的检测探究丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物,以及活性化合物木犀草素、白桦脂酸、异甘草素对细胞增殖的抑制作用。通过划痕实验计算空白区域的变化情况,观察各给药组抑制乳腺癌细胞的迁移情况。采用Annexin V-FITC/PI双染法进行流式细胞术检测两个不同萃取部位以及三个活性化合物诱导乳腺癌细胞凋亡情况的研究。利用PI染色和流式细胞术检测488nm处红色荧光下两个不同萃取部位以及三个活性化合物影响细胞周期变化情况。进行Western Blot技术检测药物作用后对乳腺癌细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白、VEGFA蛋白、周期蛋白、Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达情况。利用实时荧光定量pcr检测药效作用较好的部位及活性化合物对wnt/β-catenin通路相关基因的影响。3、采用液质联用技术对丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物、活性化合物白桦脂酸给药后的细胞内代谢物进行数据采集,得到精确分子量、裂解规律以及二级质谱数据进行多元统计分析,鉴定得到的差异代谢物结合富集分析结果明确了具体的代谢途径。结果:1、收集到丰城鸡血藤38个活性成分,相关潜在靶点388个,TNBC靶点3919个,丰城鸡血藤治疗TNBC靶点277个。主要作用于PIK3R1、PIK3CA、MAPK1、AKT1、SRC等多个靶标,主要涉及PI3K/AKT信号通路、细胞周期相关通路、癌症中的中心碳代谢（CCM）通路、癌症中的Micro RNA相关通路等与治疗TNBC有关的通路。2、各给药组对乳腺癌细胞增殖均有不同的程度的抑制作用,其中丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物以及活性化合物白桦脂酸对细胞增殖抑制作用最为显著。在丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物组作用48 h时,其IC50为91.41μg·ml-1。活性化合物白桦脂酸组作用48 h时,其IC50降低为25.95μmol·L-1。丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物、白桦脂酸可通过抑制PI3K/AKT信号通路激活,进而抑制AKT的表达从而达到抑制乳腺癌细胞生长的目的。丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、木犀草素、白桦脂酸、异甘草素可通过抑制细胞周期蛋白表达来达到阻滞细胞分裂的目的,进而抑制乳腺癌细胞增殖。与此同时木犀草素、白桦脂酸高浓度组可通过下调VEGFA表达抑制细胞侵袭,从而达到抗乳腺癌细胞增殖的目的。而在wnt/β-catenin通路研究中我们发现丰城鸡血藤三氯甲烷萃取物、木犀草素、白桦脂酸可使β-catenin蛋白表达显著降低。也发现各给药组均能显著下调Cyclin D1的表达。丰城鸡血藤三氯甲烷萃取物以及乙酸乙酯萃取物、木犀草素、白桦脂酸能够显著抑制GSK-3β蛋白的表达,并且白桦脂酸能够最为显著的抑制LRP5蛋白表达。乙酸乙酯萃取物组以及白桦脂酸组处理后的细胞APC蛋白表达上调最为显著。丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、活性化合物木犀草素高剂量组能够最为显著的诱导细胞的凋亡,且其他组也能够不同程度的诱导细胞凋亡。丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物组和异甘草素组能够最为显著的阻滞细胞处于G1期,除三氯甲烷部位萃取物组其他组也均能不同程度的阻滞细胞处于G1期或S期。3、两给药组和空白对照组细胞的代谢组数据能够明显分离,佐证了丰城鸡血藤乙酸乙酯萃取物以及单体化合物白桦脂酸的抗乳腺癌的干预作用。从差异代谢物的量化指标来看,给药后的部分生物标记物发生显著变化。共鉴定出42种差异代谢物分布于多个代谢通路中。其中有24种代谢物在萃取物组中表现为上调,17种代谢物在萃取物组中为下调。有21种代谢物在单体组中表现为上调,21种代谢物在为下调。富集分析结果发现其主要涉及到精氨酸和脯氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、氨酰-t RNA生物合成途径,差异代谢物主要与各类氨基酸和多种脂类等物质的代谢有关。结论:在MDA-MB-231细胞中,丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物以及木犀草素、白桦脂酸、异甘草素均能不同程度地抑制其增殖。除三氯甲烷部位萃取物以外其余各组也可阻滞细胞于G1期或S期以及各给药组均能够不同程度地诱导细胞凋亡。根据研究结果推断白桦脂酸表现出良好的抗乳腺癌活性可能的由于多通路多靶点的共同作用。实验发现白桦脂酸显著抑制PI3K/AKT通路的激活,以及能够降低影响细胞迁移的血管内皮生长因子VEGFA的表达,且降低能够促进细胞增殖的周期蛋白表达。与此同时在Wnt/β-catentin通路中还能有效抑制β-catentin的表达且促进APC的表达,抑制其在胞质中累计向细胞核转移,影响β-catentin与转录因子的结合,从而下调Cyclin D1表达进而抑制细胞的增殖、分化、成熟。而乙酸乙酯部位萃取物的作用机制可能与其能够抑制细胞周期相关蛋白CDK1、CDK4以及Cyclin D1蛋白有关。结合细胞周期实验结果发现,乙酸乙酯部位萃取物对于细胞周期的阻滞有较为明显的效果或与其能够较好的下调细胞周期相关蛋白有关。根据观察差异代谢物的变化情况发现乙酸乙酯部位萃取物与白桦脂酸抗乳腺癌作用可能通过引起氨基酸合成代谢、以及影响其能量来源从而发挥抑制乳腺癌细胞的作用。