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过氧亚硝酸根(peroxynitrite,ONOO-)是生物体内由一氧化氮(nitric oxide,NO·)和超氧根阴离子(superoxide,O2-·)快速结合生成的一种生物活性小分子。它具有强氧化和硝化能力,可以造成DNA、蛋白质和脂质等生物大分子的修饰与损伤,其中ONOO-介导的蛋白质酪氨酸残基硝化可能在心血管疾病、神经退行性疾病和炎症等疾病的发生和发展过程中具有重要作用。蛋白质酪氨酸硝化是一种重要的蛋白质翻译后修饰作用,它可以使蛋白质改性,使酶失活或激活,并产生一系列的细胞毒性作用,包括影响细胞信号传导通路,引起细胞能量耗竭,导致细胞的凋亡、死亡,最终可能引发疾病。但是,目前有关ONOO-诱导蛋白质酪氨酸硝化的机制、硝化的位点及位点选择性等问题尚不明确。本论文从实验和理论两方面研究ONOO-介导的酪氨酸硝化及其反应机理,并以胰岛素和p16(INK4a)蛋白为对象,通过体外实验方法,研究ONOO-诱导蛋白质酪氨酸硝化的过程、选择位点以及硝化过程中蛋白质二级结构的变化。
论文首先研究ONOO-对酪氨酸的硝化作用及其反应机理。氨基酸是蛋白质的物质组成,ONOO-对蛋白质的损伤主要通过其对侧链残基的修饰表现出来,因此研究ONOO-对酪氨酸硝化是探讨ONOO-对蛋白质酪氨酸残基硝化作用的基础。
采用量子化学计算中的密度泛函方法,从协同反应与自由基反应两条途径,对ONOO-与酪氨酸的反应机理进行研究。ONOO-可以在碱性条件下稳定存在,但在生理pH条件下,它会部分质子化为过氧亚硝酸(peroxynitrous acid,ONOOH,pKa=6.8),ONOO-与ONOOH可共存于溶液体系中。在B3LYP/6-311 G(d,p)计算水平上对该反应体系中的反应物、中间体、过渡态和产物进行几何构型优化,计算振动频率和能量。计算结果表明,ONOOH不易与酪氨酸直接反应生成3-硝基酪氨酸(3-NT),其所需能量高于ONOOH分解所需能量；ONOOH分解产生自由基·OH和NO2·后,可再与酪氨酸分步作用,主反应路径为·OH先进攻酪氨酸酚羟基H原子,生成中间体酪氨酸自由基,NO2·再与酪氨酸自由基经无势垒结合生成稳定的中间体,随后异构化为产物3-NT。在理论研究的基础上,采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱(HPLC-ESI-ITMS)方法对ONOO-与酪氨酸的反应产物进行分离、鉴定；通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振谱(1HNMR)等分析方法对收集到的主产物进行表征；采用紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)考察反应物浓度和pH等因素对酪氨酸硝化的影响。
结果显示,ONOO-与酪氨酸反应可得到两种产物,其中主产物为3-NT,次产物为羟基酪氨酸,这与理论研究结果一致。
其次,通过体外实验模拟体内环境,将ONOO-以恒定速率持续注入到蛋白质溶液中,并保持反应体系维持在生理pH条件。采用UV-Vis、HPLC-ESI-ITMS和衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)等分析方法对ONOO-诱导胰岛素酪氨酸残基的硝化过程、硝化位点以及胰岛素二级结构的变化进行研究。结果表明,生理pH条件下,ONOO-可诱导胰岛素酪氨酸硝化生成3-NT,随着胰岛素暴露于ONOO-中时间的延长,硝化产物的含量也不断增加。胰岛素分子的4个酪氨酸残基中,最多有3个可被ONOO-硝化,胰岛素硝化的混合产物中包含单、双和三硝化的胰岛素,但以单硝化胰岛素为主产物。对胰岛素A、B链进行拆分和酶解,通过肽谱分析和多肽序列测定方法确定胰岛素被硝化的3个酪氨酸残基分别是Tyr-A19、Try-B16与Tyr-B26,其中Yyr-A19是优先硝化位点,其次是Tyr-B26,最后为Tyr-B16,对于Tyr-A14却未观察到其硝化产物存在。酪氨酸残基硝化后,胰岛素分子的部分折叠结构被打开,蛋白质分子原有的α-螺旋主体结构向随意卷曲结构转变,其中α-螺旋结构含量由原来的41.7％降至19.1％,随意卷曲结构含量由原来的13.7％增至35.3％。最后,采用UV-Vis和HPLC-ESI-ITMS/MS等分析手段,研究ONOO-诱导p16蛋白的硝化过程及硝化位点。结果表明,生理条件下ONOO-可诱导p16蛋白酪氨酸残基硝化生成3-NT,随着p16蛋白暴露于ONOO-中时间的延长,p16蛋白硝化产物也不断增加。P16蛋白的两个酪氨酸残基均可被ONOO-硝化,反应混合物中包含单、双硝化产物,其中单硝化p16蛋白为主产物。通过肽谱分析和多肽序列测定方法,确定Tyr44为优先硝化位点,随着反应时间的延长,p16蛋白分子中的另一个酪氨酸残基Tyr-129也可被ONOO-硝化。
本论文通过理论和实验方法对ONOO-诱导酪氨酸以及蛋白质酪氨酸残基的硝化过程和机理进行了系统的研究。论文明确了ONOO-与酪氨酸硝化反应的路径；通过分析胰岛素和p16蛋白的硝化位点,为蛋白质硝化的选择性规律提供了新的实验证据,同时也可为进一步揭示体内蛋白质硝化的生物学功能提供依据。