荧光显微具有非接触、高对比度、高分辨、可进行特异性标记等特点,逐渐在现代生物医学研究中获得了广泛的应用。然而,随着生命科学的迅速发展,传统的荧光显微成像方法已无法满足日趋复杂的成像需求。为了研究生物大分子在三维空间的动态过程,显微系统不仅需要具备高的横向分辨率,还需要具有优异的三维成像能力与成像速度。因此,开发快速、高分辨的三维荧光显微成像技术对生命科学领域的发展具有重要意义。本文首先围绕双螺旋点扩散函数(Double-Helix Point Spread Function,DH-PSF)开展了快速三维荧光显微成像方法相关的理论与技术研究;然后,针对系统的像差问题,提出了一种基于DH-PSF的像差校正方法;最后,为了进一步提高三维荧光显微成像方法的分辨率,本文又将DH-PSF与点阵结构照明显微技术结合,开展了超分辨三维荧光显微成像方法方面的研究。具体的研究内容如下:1.提出并搭建了一套基于DH-PSF的单次曝光三维荧光显微成像系统,仅需一次曝光即可获得样品的三维信息。传统的三维成像系统需要对样品进行轴向扫描,因此成像速度十分有限。本文将宽场荧光显微成像系统的点扩散函数调制为DH-PSF,仅需拍摄一幅图像即可获得样品的三维分布。通过对计算全息图进行设计与优化,实现了对系统景深的灵活调节。另外,还提出了一种基于倒频谱的重建算法,能够同时恢复出样品的扩展景深图像与深度分布图像。这种快速三维成像方法在不牺牲横向分辨率的情况下,能够将三维成像速度提升至传统方法的10倍,并能达到23.4nm的轴向定位精度,为观测三维空间中快速变化的生命过程提供一种新的手段。2.提出了一种基于DH-PSF的无迭代像差校正方法。传统的像差测量方法通常基于迭代算法,故非常耗时(长于1分钟),甚至可能无法收敛。本文以DH-PSF作为像差指示器,提出了一种新的像差校正方法。该方法通过对实验测量的DH-PSF的形状进行分析,可以直接计算出各阶泽尼克像差的系数,大大提升了像差校正的速度(每次仅需~4s),且规避了迭代算法无法收敛的风险。这种无迭代的像差校正方法在基于PSF工程的显微系统中具有潜在应用。3.研究了点阵结构照明显微技术的超分辨原理,并通过模拟与实验对这种超分辨技术的两种重建算法的优缺点进行了对比分析。图像扫描显微由激光扫描共聚焦显微改进而来,是一种新型超分辨成像技术。由于需要进行逐点扫描,成像速度非常低。点阵结构照明显微通过并行激发与探测,解决了图像扫描显微成像速度慢的问题。首先对点阵结构照明显微的超分辨原理进行分析,并介绍了它的两种超分辨重建算法。在此基础上通过数值模拟与实验对两种重建算法的优缺点进行了比较,剖析了二者的适用范围,为后续的相关工作打下基础。4.提出了一种基于点阵结构照明与DH-PSF的超分辨三维荧光显微成像方法。现有的三维超分辨结构照明成像方法最高能够获得300nm的轴向分辨率,但依然无法区分深度差异在300nm以内的样品细节。本文在点阵结构照明超分辨显微技术的基础上,将探测光路的点扩散函数调制为DH-PSF,可以在实现横向超分辨(分辨率为136nm)的同时,使系统具备很强的轴向定位能力(定位精度约为20nm)。这种成像方法有望用于观察生物样品在三维空间的精细分布。