1半滑舌鳎vasa基因的克隆、表达分析及标记载体的构建本研究以实验室已有的半滑舌鳎转录组文库为基础,通过RACE,染色体步移等方法克隆得到半滑舌鳎vasa基因的mRNA全长序列,基因全长序列,启动子区序列以及3’侧翼区序列。发现vasa基因转录时产生3种mRNA,分别为vas-l. vas-m和vas-s。vasa基因包含23个外显子,其中外显子4的可变剪切产生vas-l.而外显子10的可变剪切产生vas-m。对半滑舌鳎vasa基因的蛋白质结构及系统发生分析均表明该基因是DEAD box解旋酶家族中的VASA亚家族的成员之一。实时荧光定量PCR证实了vasa在性腺组织的特异性表达,其中vas-s的相对表达量占决定地位。组织原位杂交实验显示vasa在性腺组织中只在精原细胞、精母细胞、卵原细胞和卵母细胞中表达,在体细胞和精子中不表达,进一步证明了vasa在生殖系细胞的特异表达,因此可以用其启动子来构建生殖系特异表达的标记载体。此外,通过荧光定量PCR,在半滑舌鳎幼鱼的性腺分化时期只检测到了vas-s的表达,尤其是在原始生殖细胞进入有丝分裂的关键时期,vas-s在雌雄鱼中的相对表达量呈相反的变化趋势。之后,在pEGFP-C1载体的基础上,我们对其进行改造,首先在绿色荧光蛋白的N端的多克隆位点处利用双酶切的方法插入了vasa基因的3’侧翼区(包括3’UTR),其次把载体上原本的人巨噬细胞病毒的启动子PcMv替换成vasa基因的启动子Pvas,最终构建成Pvas-EGFP-3’flank载体。这项研究有助于我们标记半滑舌鳎的PGCs,追踪PGCs的发生、形成以及迁移过程,可以有助于我们更深入的了解半滑舌鳎性腺的发育、成熟过程,从而获得更加有效的生殖调控手段,促进半滑舌鳎的选择育种技术的发展,并为今后进行种质资源的保存以及开展鲆鲽类的“借腹生子”等研究提供了理论基础和方法工具。2牙鲆Ddx3基因的进化研究在本研究中我们首先通过序列比对从实验室已有的牙鲆基因组和转录组文库中得到两个牙鲆的Ddx3基因。其次,我们继续通过序列比对从NCBI和Ensembl基因组数据库中找到其它脊椎动物的Ddx3基因,发现在除了雀鳝的硬骨鱼中都有两个Ddx3基因,真兽亚纲动物也有Ddx3X和Ddx3Y基因,而在其它的脊椎动物中只有一个Ddx3基因。通过系统发生分析,基因共线性分析和染色体共线性分析,我们比较了真兽亚纲Ddx3X/Y基因与硬骨鱼类的两个Ddx3基因之间的不同之处：真兽亚纲动物的Ddx3X基因原本是常染色体基因,在进化中这段染色体易位至X染色体上。而Ddx3Y基因原本是Ddx3X基因的等位基因,在进化中由于较高的替换速率,分化为新基因；硬骨鱼类的两个Ddx3基因则是由于硬骨鱼所特有的全基因组复制(TGD)导致Ddx3基因发生复制产生的。在基因共线性分析中,我们还发现了骨鳔总目Ddx3a基因与棘鳍总目Ddx3a基因的上游基因完全不同,因此进一步分析发现了从软骨鱼到硬骨鱼的进化过程中,与Ddx3a基因有关的染色体易位发生的过程。之后我们分析了硬骨鱼类Ddx3基因的基因结构和蛋白功能域,发现了Ddx3a基因和Ddx3b基因在进化中的保守性。通过PAML软件分别对硬骨鱼Ddx3a基因和Ddx3b基因在进化中受到的选择压力进行分析,发现Ddx3b在进化中受到强烈的负选择,而Ddx3a基因中有10个位点受到正选择。我们推断在这些位点受到的正选择会影响Ddx3a的RNA解旋酶和ATP酶的活性,最终会导致Ddx3a和Ddx3b在功能上的分化。而荧光定量PCR实验也证实了牙鲆Ddx3a基因和Ddx3b基因在各个组织中的差异表达,尤其是在性腺中。而且原位杂交实验也发现这两个基因只在生殖细胞中表达,说明它们在配子形成过程中承担不同的功能。因此,我们推断硬骨鱼类Ddx3基因复制后,原始基因和复制基因的进化途径是sub-functionalization。本研究是首次系统的分析了Ddx3基因在脊椎动物中的进化历程,阐述了真兽亚纲动物Ddx3X/Y基因和硬骨鱼类Ddx3基因的起源,尤其是全面研究了硬骨鱼类Ddx3基因在进化中受到的选择压力进行分析和进化路径,为今后在硬骨鱼中研究Ddx3基因的功能奠定了基础。3牙鲆p68基因的克隆及进化分析在本研究中我们首先通过序列比对从实验室已有的牙鲆基因组和转录组文库中得到两个牙鲆的p68基因,并发现了它们在转录时通过可变剪切产生3种mRNA。其中,p68a-1和p68b-1是正常的转录本,包含全部13个外显子：p68a-s和p68b-s来自内含子11的可变剪切,并在内含子11的5’端提前引入一个终止密码子,编码的氨基酸序列中缺少两个DEAD box解旋酶的保守基序；p68b-m来自于内含子12的5’部分核酸的可变翦切,由于移码突变在外显子13的5’也提前引入一个终止密码子,但是编码的氨基酸序列仍然包含DEAD box解旋酶的全部保守基序。通过荧光定量PCR检测到Ddx5基因的组织特异性表达,尤其是在性腺组织中,p68基因的相对表达量非常高。组织原位杂交实验发现p68b-s在卵巢的体细胞中表达,而p68b-1和p68b-m在卵母细胞中表达,推测p68b-s可能对p68b-1和p68b-m的表达起调控作用。与Ddx3基因类似,在多种硬骨鱼中也发现了两个p68基因,而在其它的脊椎动物中只有一个p68基因,我们通过系统发生分析,基因共线性分析和染色体共线性分析确认硬骨鱼中的两个p68基因也是由于硬骨鱼特异的全基因组复制(TGD)产生的。