研究背景细胞的死亡方式主要有两种：一种是凋亡,另一种是坏死。细胞凋亡是细胞主动的、程序化的和耗能的死亡,表现为凋亡小体形成,凋亡细胞内容物被严格包裹后清除,一般不引起炎症反应。细胞坏死是非程序化的、被动的和破坏性的细胞死亡过程,其表现为细胞能量代谢中止,内容物释放到周围组织中去,引起炎症反应。与细胞凋亡相比,细胞坏死最核心区别是坏死细胞的内容物可以释放到周围组织中。研究表明,坏死细胞可促使免疫系统释放大量炎性分子,通过一系列的信号级联反应,在炎症中发挥作用。坏死细胞对免疫系统作用主要有：(1)促进炎症因子释放；(2)活化固有免疫系统,使其释放固有免疫分子；(3)抗感染；(4)诱导自身免疫性疾病等。有关细胞坏死的免疫作用研究进展主要有：(1)细胞坏死机制与细胞因子结合死亡受体、离子通道受到破坏、活性氧的释放及线粒体损伤、蛋白激酶的表达增强等有关；(2)细胞坏死后可以释放多种炎性因子促进炎症发生；(3)细胞坏死后可趋化多种吞噬细胞到达局部组织发挥不同作用；(4)吞噬细胞吞噬坏死细胞后,通过释放多种细胞因子调节免疫；(5)多种炎性分子可激活死亡受体诱导的细胞程序化坏死。然而,坏死细胞对不同CD4+T细胞亚群平衡的调节作用仍不清楚。在CD4+T细胞中,目前已知有Th1、Th2、Treg, Th17、Tfh、Th9、Th22等多个功能亚群。调节性T细胞(Treg)是一组具有抑制其它免疫细胞功能的细胞,在自身免疫耐受中起着非常重要的作用。Th17是以产生IL-17为特点的新型T细胞亚群,其在免疫调节、抗感染免疫反应和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。若CD4+T细胞亚群发生改变,则意味着免疫异常,并可能与疾病的发生发展有关。一般认为,Th1和Th2细胞间存在平衡关系,Th细胞前体在抗原刺激情况下分化为Th0细胞,Th0细胞在不同微环境下,由不同细胞因子作用后选择性的分化为Th1或Th2细胞。Th1/Th2细胞失衡参与多种疾病发生发展。有文献认为,Treg/Th17也存在免疫平衡。其主要依据是：在微环境中仅有TGF-β存在时,TGF-P同时诱导Foxp3和RORγt表达,但Foxp3抑制了RORγt活性,使初始T细胞不能分化为Th17细胞。如果微环境中TGF-β持续存在、且有IL-2和RA时,初始T细胞向Treg分化；相反,微环境中TGF-β持续存在,且有IL-6, IL-21和IL-23时,则Foxp3的活性受到抑制,初始T细胞分化为Th17细胞。目前已知机体中,凋亡和坏死细胞都能够释放不同促进吞噬信号,而无论是凋亡细胞还是坏死细胞均能够促使其吞噬细胞分泌大量TGF-β。坏死细胞同时还可以促进IL-6等其他炎性细胞因子释放。根据不同CD4+T细胞亚群的平衡关系,让我们认为,不同方式死亡细胞可能对CD4+T细胞亚群间平衡存在不同的调节作用。凋亡细胞刺激其吞噬细胞分泌TGF-β等因子,同时抑制IL-6等炎性因子促进Treg的诱导。而坏死细胞通过刺激吞噬细胞分泌TGF-P同时促进IL-6等炎性因子的分泌促进Th17的诱导。凋亡细胞/坏死细胞通过自身释放或刺激抗原递呈细胞分泌炎性因子(如IDO、HMGB1等)以调节Th1/Th2的分化。目前已经证实,凋亡细胞能够调节不同T细胞亚群比例。输注凋亡细胞可以诱导Treg细胞的产生,还可以抑制Th17细胞分化和发育所必需的P-STAT3的产生。而坏死细胞刺激其吞噬细胞分泌IL-6,同时大大增强LPS刺激后的IL-6分泌,同时IL-6可以抑制Treg的生成。作为坏死细胞释放的炎性蛋白HMGB1,在高浓度下刺激淋巴细胞向Thl方向分化。凋亡细胞被吞噬后释放的IDO也能够影响到Th1/Th2平衡。但是在体内实验中,坏死细胞对T细胞功能亚群平衡的调节作用仍不清楚。根据孙尔维教授提出“细胞死亡免疫识别模型”理论模型,坏死细胞是诱导免疫应答关键。进一步研究坏死细胞对不同T细胞亚群的作用,对证明“细胞死亡免疫识别模型”的细胞和分子机制、寻找调节免疫的关键细胞和分子、从免疫平衡角度探讨免疫相关疾病的机制和防治等,具有重要意义。目的本研究着眼研究以下内容：1.坏死细胞对正常小鼠体内CD4+T细胞亚群的影响；2.观察预输注GdCl3后,坏死细胞对小鼠体内CD4+T细胞亚群的影响；3.脓毒症模型中,预输注坏死细胞对小鼠体内CD4+T细胞亚群的影响；4.体内无菌性炎症中(缺血再灌注)对体内CD4+T细胞亚群的影响；5.坏死细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠体内CD4+T细胞亚群的影响方法1.将26只6-8周龄SPF级Balb/C小鼠随机分为三组。第一组为PBS对照组(n=6),腹腔注射PBS 200μl；第二组活细胞组(n=10),腹腔注射2×107个活胸腺细胞；第三组为坏死细胞组(n=10),腹腔注射2×107个(200μ1)未经任何处理的坏死细胞。于2周后处死所有实验小鼠,流式细胞仪分别检测外周血、脾脏、胸腺中CD4+Foxp3+Treg细胞、CD4+IL-17A+Thl7细胞、CD4+IFN-Y+Th 1细胞以及CD4+IL-4+Th2细胞比例。(1)坏死细胞的制备6周龄SPF级Balb/C、鼠3只,处死后迅速取出胸腺研磨,PBS洗涤制备细胞悬液并计数。调整细胞浓度后56℃水浴1小时。坏死率判断使用Annexin V FITC和PI染色,流式细胞仪检测。(2)CD4+T细胞亚群的检测肝素抗凝采血。分离脾脏、胸腺,用5ml注射器平端研磨,PBS洗涤细胞,200目金属滤网过滤,10%小牛血清的1640培养基重悬细胞,制备成单细胞悬液,细胞浓度1×107/ml。分别加入PMA(终浓度100ng/ml)、Ionomycin(终浓度1 μg/ml)以及BFA 10ng/ml,放置37℃,5%CO2孵箱孵育6小时。孵育后的细胞用PBS洗涤,加入FITC-CD4抗体1μl,4℃避光孵育60min。外周血裂红并洗涤2次。所有样本加PBS洗涤1次,弃上清。加入Foxp3检测打孔/固定浓缩液1ml,并旋涡混匀,置于4℃避光孵育60分钟。再加入2ml稀释至1×的透化工作液洗涤细胞,重悬细胞。每样本再分为两管,一管加入抗Foxp3抗体0.5gl,抗IL-17A抗体1μl,另一管加入抗IL-4抗体以及抗IFN-7抗体各1μl。设立同型对照管,加入抗Foxp3抗体0.5nl, PE-IgGl k及PE-Cy7-IgGl k各1μl,置于4℃避光孵育60分钟后,加入2ml透化工作液洗涤细胞2次,冷PBS重悬细胞,迅速上流式细胞仪检测。2.将23只6-8周龄SPF级Balb/C小鼠随机分为四组。第一组PBS对照组(n=5),连续9天腹腔注射200μl的PBS；第二组为GdC13对照组(n=6),第1天、第3天尾静脉注射1mg/ml的GdCl3 200μl,第三天起连续7天腹腔注射PBS 200μl第三组为坏死细胞对照组(n=6),连续9天腹腔注射2×107个坏死细胞(200μ1)；第四组为实验组(n=6),于第1天、第3天尾静脉注射1mg/ml的GdCl3 200μl,同时连续9天腹腔注射2×107个坏死细胞(200μ1)。所有动物于第23天后处死,流式细胞仪分别检测外周血、脾脏、胸腺中Treg细胞、Th17细胞、Thl细胞以及Th2细胞比例(方法同前所述)。3.将19只SPF级10～12周龄C57BL/6小鼠随机分成三组：肾缺血再灌注组(RIR组,n=7)、假手术对照组(Sham组,n=7)、正常对照组(n=5)。RIR组小鼠在麻醉情况下,开腹并将左侧肾蒂钳夹阻断血流1小时后再开放血流。Sham组小鼠麻醉后仅开腹并分离左侧肾蒂,不做其他特殊处理。正常对照组为同批次小鼠,正常饲养,无特殊处理。手术后第14天处死所有小鼠,取左右两侧肾脏送病理检测。取外周血、脾脏和胸腺,流式检狈Treg细胞、Th17细胞、Th2细胞以及Thl细胞比例(方法同前所述)肾缺血再灌注小鼠模型的制备1%戊巴比妥钠200μL腹腔注射麻醉小鼠,常规碘酒酒精消毒,腹正中切口,用无菌棉签牵开胃肠,并用预热(37℃)的生理盐水湿润的纱布覆盖包裹。暴露左侧肾蒂,,用微血管夹同时夹闭肾动静脉。1小时后松开并取出微血管夹,观察肾血流是否重新恢复。再灌注成功后,逐层关腹腔,75%酒精消毒,背部皮下注射50%1生理盐水。4.将34只SPF级10～12周龄C57BL/6小鼠随机分成四组：正常对照组(PBS组,n=5)、假手术对照组(Sham组,n=5)、脓毒症组(CLP组,n=12)以及坏死细胞处理脓毒症组(CLP+Nec组,n=12)。正常对照组腹腔注射200μL的PBS一次,假手术组在小鼠麻醉后,仅分离盲肠末端后,不进行结扎穿孔。脓毒症组小鼠采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症模型。坏死细胞处理脓毒症组首先腹腔注射2×107个坏死细胞,第5天行盲肠结扎穿孔。手术后第14天处死所有存活小鼠,取肝脏、肺脏、肾脏送病理检测。取外周血、脾脏和胸腺,流式检测Treg细胞、Th17细胞、Th2细胞以及Th1细胞比例(方法同前所述)。脓毒症小鼠的制备1%戊巴比妥钠200gL麻醉小鼠后,常规消毒腹部,腹正中切口后,小心分离盲肠远端与大肠系膜,在盲肠远端1/2处用无菌4号丝线结扎,并用无菌7号针头在已结扎盲肠远端中央处贯通穿刺,挤出少许内容物后把盲肠推回腹腔,逐层缝合关闭腹腔。假手术组分离盲肠末端后,不进行结扎穿孔,暴露30秒后,直接关闭腹腔,逐层缝合。75%酒精消毒切口。术后立即背部皮下注射生理盐水50ml/l(g.5.将26只8-10周龄雌性C57BL/6小鼠随机分成三组：正常对照组(PBS组,n=6).EAE模型组(n=10)、注射坏死细胞EAE组(EAE+Nec组,n=10)EAE组小鼠制备EAE疾病模型后,连续9天腹腔注射200μl无菌PBS;EAE+Nec组小鼠在制备EAE模型后,连续9天腹腔注射2×107个坏死细胞(200μ1)；PBS组小鼠为同批次正常小鼠,连续9天腹腔注射200μl无菌PBS。所以小鼠于制备EAE模型后第14天处死,取外周血、脾脏和胸腺,流式细胞仪检测其中Treg细胞、Th17细胞、Th2细胞以及Thl细胞比例。EAE小鼠模型的制备200μg/ml多肽MOG35-55与等体积含5mg/ml结核分枝杆菌H-37 RA的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后,取200μ1给小鼠皮下多点注射法免疫。分别于第0天和第2天,每只小鼠腹腔注射500ng百日咳毒素(200μl),连续观察小鼠状态及评分。6.统计学分析采用SPSS 16.0软件进行单向方差分析,分别比较各组间外周血、脾脏和胸腺中的T细胞亚群比例占CD4+T细胞的比例有无差异,所有数据以均数±标准差(X±SD)表示。结果1.小鼠胸腺细胞悬液经56℃水浴1小时后。流式细胞技术检测,细胞坏死率达到99%以上,可以用于下一步实验。2.坏死细胞对正常小鼠CD4+T细胞亚群的影响。(1)与输注活细胞组相比,单次输注坏死细胞后能够显著增加小鼠外周血中的Thl及Th2细胞占CD4+T淋巴细胞的比例(FTh1=4.671,PTh1 vs Living=0.024；FTh2=5.576, PTh2 vs Living=0.014) 。与输注活细胞或者输注PBS相比,输注坏死细胞还可显著降低小鼠胸腺中的Th1细胞占CD4+T细胞的比例(FTh1=6-827, Pvs living cells =0.004, evs PBS =0.005) 。单纯输注坏死细胞,对小鼠体中Th 1/Th2 与 Treg/Th 17的比值无影响。(2)用GdC13抑制巨噬细胞,再连续9天给小鼠输注坏死细胞后,和其他3组相比,在外周血中输注坏死细胞组小鼠Th1及Th2细胞占CD4+T淋巴细胞的比例显著升高(FTh1=3.883, PTh1 =0.025; FTh2=3.468, PTh2 =0.037) 。此外,与PBS对照组相比,输注坏死细胞可以显著抑制外周血中Treg细胞占CD4+T细胞比例( FTreg=4.251, PTreg vs FBS=0.039 ) 。而GdCI3+坏死细胞组小鼠外周血中Treg细胞占CD4+T细胞比例亦显著低于PBS组和GdC13组(FTreg =4.251, Prreg vs PBS=0.004, PTreg vs GdCl3=0.021 ) 。输注坏死细胞组小鼠脾脏中的Th1及Th2细胞占CD4+T淋巴细胞的比例,和其他3组相比显著升高(FTh1=12.112, PTh1 =0.000; FTh2=7.169, PTh2 =0.002) 0与PBS组相比,输注坏死细胞或GdC13后,均能够显著降低小鼠胸腺中Th1及Th2细胞占CD4+T细胞的比例(FTh1=30-385, PTh1 =0.000; FTh2=63.084, PTh2 =0.000) 。输注GdCl3+坏死细胞后,小鼠胸腺内Th1, Th2占CD4+T细胞比例与单纯输注GdC13组相比,同样有显著降低(PTh1 vs GdC13 =0.016, PTh2 vs CaCls=O.O00)。与PBS组相比,输注GdCl3或GdC13+坏死细胞后后,小鼠胸腺中Th17细胞占CD4+T细胞的比例显著降低(FThl7 =18.211, PTh17=0.000)o与PBS组相比,连续输注坏死细胞能够显著升高小鼠外周血中Th1/Th2比值(F=2.372,/’Nee VS PBS =0.020)。输注坏死细胞或GdC13+坏死细胞后,小鼠外周血中Treg/Th 17比例与PBS组相比,则有显著性降低(F=41.354, PNec vs PBS =0.000, PNec+GOCl3 VS PBS =0.000) 。3.肾脏缺血再灌注对小鼠体内CD4+T细胞亚群的影响RIR术后14天,小鼠外周血中Th1细胞占CD4+T细胞的比例,与sham组相比有增加,差异具有统计学意义(FTh1=3.498, PRIR vs Sham=O.026 ) 。与sham组比,RIR组小鼠外周血Th17细胞的占CD4+T淋巴细胞的比例亦有显著增高(FTh17=4.942, PRIR vs Sham=0.006)。与正常对照组和RIR组小鼠相比,Sham组小鼠脾脏中Th1亚群占CD4+T比例降低,差异具有统计学意义(FTh1=6.236, PTh1 =0.010)。与Sham组小鼠相比,RIR组小鼠脾脏中Th17亚群占CD4+T比例增高,差异具有统计学意义(FTh17=6.236, PRIR vs Sham=0.024)。 RIR组小鼠胸腺内Th1细胞占CD4+T细胞的比例高于正常对照组或者Sham组,差异具有统计学意义(FTh1=8.949, PTh1=0.017)。与正常对照组和RIR组小鼠相比,Sham组小鼠脾脏中Th17亚群占CD4+T比例降低,差异具有统计学意义(FTh17=8.139, PTh17=0.009)。与正常对照组小鼠相比,Sham组和RIR组小鼠胸腺中Treg亚群占CD4+T比例显著降低(FTreg=4.566, PTreg=0.027)。进一步计算了小鼠体内Th1/Th2与Treg/Th17的比例,我们发现,RIR组小鼠体内Th1/Th2的比值与Sham组相比,均有增高,差异具有统计学意义(F Blood Th1/Th2=5.472, P Blood Th1/Th2 =0.015; Fspleen Th1/Th2=18.247, PSpleen Th1/Th2=:0.000; F Thymus Th1/Th2=9.771, Pyhymus Th1/Th2=0.008)。在外周血中,RIR组与正常对照组小鼠Treg/Th17比值显著低于Sham组(F Blood TregATh17=9-993, P Blood Treg/Th17=0.002)。RIR组小鼠胸腺中Treg/Th1比值与正常对照组及Sham组相比有显著降低,差异具有统计学意义(F Thymus Treg/Th17=56.122, P Thymus Treg/Th17=0.000) 。4.坏死细胞对脓毒症小鼠模型体内CD4+T细胞亚群的影响(1)CLP法可以有效制备脓毒症小鼠。小鼠总死亡率54.2%,病理可见造模成功。(2)CLP手术造模后第14天,Sham组、CLP组及CLP+坏死细胞组小鼠外周血中的Th1细胞占CD4+T淋巴细胞的比例与正常对照组相比均有显著减低(FTh1=14.321, PTh1=0.000)。其中,预先输注坏死细胞的CLP+Nec组的Th1/CD4+比例与脓毒症造模CLP组相比亦有显著性降低(FTh1=14.321, PCLP+Nec VSCLP =0.033).同时,CLP+Nec组的Th2/CD4+比例与PBS组相比亦有显著性降低(FTh2=2.314, PCLP+Nec=0.024)。与PBS组相比,Sham组、CLP组及CLP加坏死细胞组小鼠外周血中的Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例均有显著减低(FTreg=3.201, Prreg=0.050).脓毒症造模后,CLP组及CLP+Nec组小鼠外周血CD4+细胞的比例低于PBS对照组及Sham对照组,差异具有统计学意义(FcD4 =10.261, PCD4=0.QO0)c CLP组小鼠脾脏中的Th1细胞占CD4+T淋巴细胞的比例低于正常对照组,差异具有统计学意义(FThi=9.701, Pclp vs pbs=0.007)o与PBS对照组相比,Sham组、CLP组以及CLP+Necrosis组小鼠脾脏Th2/CD4+值均有显著性降低(FTh2=12.137,PTh2=0.002)=检测小鼠Thl7/CD4比例,我们发现CLP组小鼠脾脏中Thl7/CD4比值高于其他三组,差异具有统计学意义(Ftt,i7=5.513, Pnn=0.008). Sham组、CLP组以及CLP+Necrosis组小鼠脾脏Treg占CD4+T比例均显著低于PBS对照组(FTreg=12.155,?Thn=0.000),但此三组之相互无统计学差异(P>0.05)。CLP+Necrosis组小鼠胸腺内Th2/CD4+T比例低于Sham组小鼠,差异具有统计学意义(Fjh2=2.368, PcLP+Nec vsSham=0.039) ■CLP组小鼠胸腺内Treg占CD4+T比例显著低于Sham组小鼠和CLP+Necrosis组小鼠(FTreg=3.683, PCLP vs Sham=0.007, PCLP vs CLP+Nec=0.021).进一步计算各实验组及对照组小鼠体内外周血和脾脏中Th1/Th2与Treg/Th17的比例,我们发现,CLP组小鼠外周血Th1/Th2的比值不但高于PBS组与Sham组小鼠,同时也高于CLP+Necrosis组,差异具有统计学意义(FBlood Th1/Th2=10.482, PBlood Th1/Th2=0.000)c但是在脾脏中, Sham组与CLP+Necrosis组内的Thl/Th2比值则显著高于CLP组与PBS组,差异具有统计学意义(FspieenTh1/Th2=12.273,PSpleen Thl/Th2=0.000)o与PBS组相比,Sham组、CLP组及CLP+necrosis组小鼠脾脏内 Treg/Th17的比值显著降低,同时CLP组小鼠脾脏内Treg/Th17比值又低于Sham组与CLP+necrosis组,差异具有统计学意义(Fspleen Treg/Th17=29.641, Pspleen Treg/Th17=0.000)o5.坏死细胞对EAE小鼠体内CD4+T细胞亚群的影响(1)皮下注射MOG35-55抗原肽可有效诱导EAE小鼠模型。至第14天实验截止,EAE组与EAE+Nec组小鼠总发病率90%(18只/20只)。(2)EAE造模后,小鼠外周血Th17比例亦显著高于PBS组(P=0.005),同时小鼠脾脏中Th1、Treg细胞比例显著降低(PTh1 =0.026, PTreg =0.026)。 EAE模型脾脏中Th1/Th2比例显著低于PBS组(P=0.001)。给EAE模型小鼠输注坏死细胞后,其可显著升高外周血Th17细胞比例(PNec vs eBB=0.000, P Nec vs EAE=0.005),同时升高脾脏中Th17细胞比例(PNec vs EA~=0.004) 。坏死细胞还可协同EAE模型降低小鼠脾脏中Treg细胞比例(PNec vs PBS =0.000)。 EAE组与EAE+Nec组间Treg比例无统计学差异( P EAE vs Nec =0.070 ) 。 EAE+Nec组小鼠胸腺中Th1, Th17, Treg细胞占CD4+T比例显著低于EAE组小鼠(PTh1=0.034, PTh17=0.002, PTreg=0.001 )。输注坏死细胞后,可促使EAE小鼠脾脏中中Treg/ Th17比例显著降低( -19 Nec vs EAZ=0]006),胸腺中Th1/Th2比例显著升高( P Nec vs EAe=0.003 ) 。结论1.单纯输注自体坏死细胞可以同时上调小鼠外周Th1, Th2的比例,促使Th1/Th2平衡向Thl方向偏移。坏死细胞持续刺激下,这一作用更为明显。坏死细胞这一作用,与巨噬细胞功能有关。使用GdC13抑制小鼠体内巨噬细胞功能后,坏死细胞对Th1, Th2的作用消失。坏死细胞和GdCl3均可抑制小鼠胸腺中Th1, Th2细胞比例,两者有协同作用。GdCl3还可以抑制小鼠胸腺中Th17细胞比例。输注坏死细胞还可抑制小鼠外周血Treg细胞比例,导致Treg/Th 17失衡偏向Th17方向。GdCl3抑制巨噬细胞后,不影响坏死细胞对Treg的抑制。单纯输注自体坏死细胞对Th17细胞比例无影响。2.单侧肾缺血再灌注模型(RIR)中,手术本身会降低小鼠脾脏中Th1比例以及胸腺中Treg细胞比例。和假手术相比,RIR显著上调小鼠外周、脾脏及胸腺中Th1, Th17细胞比例。导致小鼠体内Th1/Th2平衡向Th1方向偏移,Treg/Th 17平衡向Th17方向发展。3.脓毒症模型中,手术本身会降低小鼠外周Th1, Th2, Treg细胞比例。但相对假手术,脓毒症会对促使小鼠外周血中Th1/Th2平衡向Th1方向偏移,脾脏中Th1/Th2平衡向Th2方向偏移。同时,脓毒症可以上调小鼠脾脏中Th17比例,导致Treg/Th17平衡向Th17方向发展。此外,和假手术组相比,脓毒症小鼠胸腺中Treg的比例有显著降低。预先输注坏死细胞,可以逆转上述脓毒症对Th1、Th2、Th17及Treg的作用。4.我们利用抗原MOG35-55联合佐剂刺激的方法制备小鼠实验性自身免疫性脑炎模型,再连续输注坏死细胞。结果显示EAE小鼠外周血Thl7细胞比例增高,而脾脏中Treg细胞比例降低。EAE模型可以降低小鼠脾脏中Th1/Th2比值,使Th1/Th2平衡向Th2偏移。给EAE小鼠输注坏死细胞后,我们发现坏死细胞可以协同EAE模型显著上调小鼠外周血和脾脏中Thl7比例,抑制胸腺中Treg细胞比例,促使外周血和脾脏中Treg/Th17平衡向Th17方向偏移。坏死细胞对小鼠外周血和脾脏Th1、Th2以及Treg细胞比例的影响与正常小鼠模型一致。综上,坏死细胞在持续存在的情况下,其主要通过巨噬细胞上调Th1、Th17比例,同时下调Treg细胞比例发挥促炎作用。坏死细胞还能够与其他机制炎症发挥协同作用。