在过去的20年内,荧光标记技术与双光子显微技术的发展为神经科学的研究提供了重要的研究工具,使在体跟踪与操纵神经元、胶质细胞和微脉管系统成为可能,从而更有效地理解大脑。然而皮层上方颅骨的混浊特性严重制约了光学成像对皮层结构与功能的观察。为此,研究人员通过将颅骨完全或者部分去除的方式,建立了多种颅窗,但都存在一定的弊端与不足。组织光透明通过降低组织的散射,为克服浑浊颅骨对光学成像的制约提供了全新的思路。但现有研究多局限于离体组织与器官,针对活体组织的光透明研究较少。本文的工作正是围绕活体颅骨光透明而展开的,旨在建立高效、安全、操作简便的光透明颅窗,实现细胞、亚细胞分辨水平的穿颅活体皮层成像。本文的主要内容如下:(1)颅骨光透明试剂的选型与方法的构建:基于颅骨特殊的分层结构及组分,以简便、高效、快速为原则,通过离体和在体实验对颅骨光透明试剂进行选型,最终确定颅骨光透明试剂由胶原蛋白酶、乙二胺四乙酸二钠和甘油组成;针对不同年龄的小鼠,确立适用于活体皮层成像的光透明颅窗的实施方案。(2)光透明颅窗实施活体皮层成像的性能评估:开展活体皮层成像实验,从有效性、重复性、与荧光蛋白/染料的兼容性等方面对光透明颅窗的性能评估。结果显示,实施颅骨光透明处理后,光学成像的信噪比、分辨率与成像深度得以极大地提高,获取了亚细胞分辨水平的皮层结构信息,实现了皮层250μm深度内神经元、胶质细胞和血管的高分辨重复成像。(3)光透明颅窗的安全性评估:光透明颅窗结合多种光学成像技术,观测皮层免疫细胞的短期与长期响应、皮层星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白的表达、以及皮层血流分布或血管重构与再生,评估光透明颅窗的安全性。结果显示该颅窗既未激活皮层的小胶质细胞,也未引起皮层胶质纤维酸性蛋白表达的上调;既未改变皮层血流分布,也未引起软膜血管重构与再生,从而证明该颅窗的安全性。(4)光透明颅窗的初步应用:(1)激光损伤后皮层树突和小胶质细胞形态变化的动态观测;(2)脑梗塞后皮层树突和小胶质细胞形态变化的动态观测;(3)发育关键期皮层突触可塑性的动态观测。结果显示,激光损伤后,损伤区域树突形成串珠状结构,而损伤区域小胶质细胞的突起朝向损伤部位运动,这与文献结果一致;脑梗塞后,梗塞区域树突迅速形成串珠状结构,这与文献结果一致。梗塞区域小胶质细胞并没有迅速被激活,在梗塞后的24小时其形态和分布均发生剧烈变化,从而证实小胶质细胞的浸润时间窗为0–24小时之间;通过对第三周小鼠皮层突触可塑性的动态观测,发现关键期小鼠皮层树突棘和丝状伪足的能动性很高,其桶状皮层树突棘在1小时内的新生率和消亡率分别为3.20±0.36%和1.83±0.91%,并观察到丝状伪足转变成树突棘结构,这暗示了丝状伪足可能是树突棘的前体。综上所述,本文构建了一种适用于活体皮层成像的光透明颅窗,通过在颅骨表面涂抹光透明试剂来减小颅骨的散射,形成一个可观测皮层的视窗。与双光子成像相结合,实现对皮层神经元、胶质细胞和血管的高分辨活体成像研究。此颅窗具有高效、安全、可重复且操作简便等特点,既能实现对皮层细胞、亚细胞水平结构的跟踪观察,也可实现对皮层特定区域的靶向操纵。这种光透明颅窗有望为生理或疾病状态下皮层神经、血管的结构与功能性成像研究提供重要工具。