研究目的现阶段,药用植物生物活性物质的医学价值,逐步遭到认可和重视,大量的学者纷纷将研究的重心,转移到对药用植物医学价值的探索中。在我国传统医学中,从很早的时候,便认识到姜黄的医用价值,并且明确记载姜黄具备扶正祛邪等医疗效用,在医疗实践中广泛应用。目前研究认为姜黄属植物提取物主要成分为姜黄素类和类姜黄素类化合物以及其主要化合物。此外还有糖类、类姜黄素类、多肽类、姜黄素类等化合物。同时,在姜黄素提取物里面,有一种颜色呈黄色的多酚类化合物,即是姜黄素(curcumin)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)和双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin)的混合体,大多数学者将其定义为姜黄色素类化合物。同时,在姜黄色素中,其主要的活性成份,即是姜黄素。由于姜黄素的医用价值逐步得到国内外诸多学者的认可和重视,从而在不断的研究中,姜黄素所拥有的生物活性先后被开发和挖掘,目前,所知的功效主要为抗氧化清除自由基、抗肿瘤等,然而,在针对其提取物免疫调节功能,以及毒理学安全性的介绍,却十分匮乏。本课题拟通过整体动物实验系统研究姜黄素提取物毒性和免疫调节功能,为姜黄素在功能食品方面的应用提供理论依据。方法与结果1.姜黄素提取物毒性研究急性毒性试验:为了测试姜黄素的提取物急性毒性情况,本实验采用限量法实施试验工作。其中,共选取20只小鼠,雌、雄各一半,对每只小鼠经口给予20g/kg.bw姜黄素提取物,经14天的观察记录后,结果LD50>20g/kg.bw,因此得出结论,姜黄素为无毒物质。遗传毒性试验:本实验采用Ames试验平板掺入法,来测定姜黄素提取物的遗传毒性情况,同时,为了提高实验的客观性和对比性,本实验方案设定了加S-9、不加S-9混合液等实验小组,剂量分别为5000、1000、200、40、8μg/皿,每个组别设3个平皿。在完成增菌培养的实验环节后,采用无菌小试管将融化顶层培养基进行装置。并且将顶层培养基2 ml,放置在45℃水浴里面进行保温,同时先后将测试菌株新鲜增菌液0.1 ml、受试物0.1 ml注入其中,缓慢摇晃后,使其快速的与底层培养基进行融合,待其均匀分布后,水平放置,直至其完全固化为止。之后,再将其放置在37℃的温度中进行培养,2天后,观察记录。为了提高实验的客观性,再次进行阳性对照、溶剂对照等试验。整套试验在相同条件下进行两次。其中,试验结果表明,在先后的两次试验中,培养皿中的自发挥菌落数始终保持在受试物各剂量组回变菌落数2倍的范围内,并且尚未出现剂量反应关系,从而证实了当受试物剂量控制在8～5 000 μg/皿的时候,鼠伤寒沙门氏菌四株试验菌株无致突变作用。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验:在实施该项试验方案时,共挑选50只SPF小鼠,25只雌鼠、25只雄鼠,随机分成5个小组。实验设立3个实验组,染毒剂量分别为2.5、5.0、10.0g/kg.bw,另设两个在对照组(阴性组环磷酰胺阳性对照组)。共取三份受试物,其剂量分别为2.5、5.0、10.0g,采用植物油对其进行配比,直至20ml,并确保其终浓度依次为0.125、0.250、0.500g/ml,灌胃于实验动物。灌胃量为0.2ml/10g.bw,共两次,间隔24h。得到结果如下,当最后一次给予受试物后,小鼠于6h后麻醉处死。通过抽取死亡小鼠骨髓,进行涂片检验后,在每一只动物骨髓图片上镜检至少1000PCE高达1000个。同时,有针对性的对200个PCE进行观察记录,计算并确认其NCE数目和PCE/NCE比值。由结论可知,在微核率上,阴性对照组与受试物各剂量组两个小组之间并无较大差异(P>0.05)。小鼠精子畸形试验:SPF小鼠随机分为5组,每组5只。并且分别设定了 3个实验组,将其染毒剂量依次设定为2.5、5.0、10.0g/kg.bw,为了提高实验的可比性,设定植物油阴性、环磷酰胺阳性两个对照小组。共取三份受试物,其剂量分别为2.5、5.0、10.0g,采用植物油为溶剂对其进行配制,直至20ml,并确保其终浓度依次为0.125、0.250、0.500g/ml,通过灌胃的方式,给予实验动物。灌胃量为0.2ml/10g.bw,每日一次,连续5d。实验结论证实了,在精子畸变率上,阴性对照组与受试物各剂量组两个小组之间,并没有出现较大的差异化,无统计学意义(P>0.05),然而,其与环磷酰胺阳性组比对时,却出现了极为显现的差异(P<0.01),表明该样品无致小鼠精子畸变作用。大鼠30d喂养试验:SPF级健康大鼠共计80只,随机分为4个小组,每组20只,雌性小鼠10只雄性小鼠10只。设立3个实验组,染毒剂量分别为1.5、3.0、6.0g/kg.bw(分别相当于人体推荐量的25、50、100倍)。以植物油为溶剂将样品分别配至所需浓度。同时设立溶剂对照组。在30天内,对每一只动物都以1.0ml/100g.bw/天的计量,对其实施经口灌胃,并且在24h内,对灌胃给予动物的行为特征、中毒程度及其死亡几率进行观察记录。每天2次对动物进行灌胃给药,每隔7天,对每只动物进行称量,并以表格的形式,记录每周的食物利用率以及总食物支出。在实验末期,对每只动物进行16h的禁食,并称量其体重。取血位置为腹主动脉,取血完毕后,对动物实施解剖,并实时取材。血液学测定血液学测定采用K2EDTA-抗凝血。同时,除了进行血液测定之外,还需要受试物的主要脏器进行称量,计算得出脏器系数。经过一系列的实验,结果证实了在本次的试验期间内,各剂量组动物都表现出良好的生长状况,以及其食物利用率、体重增重程度等指标都十分正常,在血液检验中,其各项血液指标都在正常范围内。虽然在实施病理组织学检查时,发现在高剂量组、对照组两个小组中,存在部分标本产生了病变,但是其表现程度都十分轻微,并且无组间特异性分布,不能界定为具备毒理学意义。2.姜黄素提取物对小鼠免疫功能的影响在本实验中,所挑选的小鼠为SPF级ICR小鼠,为了提高实验的客观对比性,本次共设定3个剂量组,即:0.30、0.60、1.80g/kg.bw,同时设立溶剂对照组,连续30天,对小鼠进行经口灌胃,其剂量为0.1mL/10g.bw/天,并对其各项指标加以检测。针对小鼠细胞免疫功能的检测,其涉及的内容主要为细胞免疫功能测定包括小鼠脾淋巴细胞转化实验和迟发型变态反应实验,针对体液免疫功能测定采用的是血清溶血素测定和抗体生成细胞检测,单核-巨噬细胞功能测定采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和小鼠碳廓清实验,以及NK细胞活性测定。实验结果显示:在淋巴细胞转化能力OD差值上,本次实验的0.30、1.80g/kg.bw剂量组与对照组两个小组之间,表现出了十分显现的差异特征(P<0.05);并且,在HC50上,0.60、1.80g/kg.bw剂量组与对照组之间,也表现出明显的差异(P<0.05)。但是,各剂量组动物碳廓清吞噬指数、细胞吞噬鸡红细胞百分率及吞噬指数、NK细胞活性与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论1.本次的实验条件下,结果表明,黄素提取物未显示有明显毒性作用,因此,在食品开发中,其有较高的安全性。2.本次的实验条件下,结果证明了姜黄素提取物在提高免疫力上,有较好的促进作用。