论文部分内容阅读
猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）分为4种,猪圆环病毒1型（PCV1）,猪圆环病毒2型（PCV2）,猪圆环病毒3型（PCV3）和猪圆环病毒4型（PCV4）。PCV1对猪无致病性;PCV2是威胁世界养猪业重要病原之一,给养猪业造成了巨大经济损失;PCV3作为一种新发病毒,2016年在美国首次报道,被认为与猪的多种临床疾病相关,呈世界范围内流行;2019年PCV4首次在中国发现,其流行情况和致病性目前还不确定。我国是世界养猪业和猪肉消耗量最大的国家,比例占世界一半以上。而我国猪群PCV2和PCV3感染广泛,且已造成危害。本研究旨在对我国猪群中PCV2和PCV3的分子流行病学进行调查,明确目前PCV2和PCV3在猪群中的感染状况,遗传变异和进化规律,对流行毒株进行分离鉴定和致病性研究。同时,针对当前流行毒株开展PCV2和PCV3二联重组腺病毒疫苗研究,通过动物试验对疫苗的免疫效果和对流行毒株的保护效果进行了评估,为防控PCV2和PCV3的感染奠定基础。本研究具体结果如下:（1）为明确PCV2在我国的分子流行病学特征,针对2016-2019年间,我国9省份206个猪场的3201份猪临床样本进行PCV2检测。PCV2在猪群中总阳性率为39.6%（1269/3201）,不同省份阳性率为18.6%-44.7%;在猪场水平阳性率为84.5%（174/206）,表明PCV2在我国猪群中感染率很高。为进一步研究PCV2的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组和ORF2基因的扩增,共获得了64个PCV2的全基因序列和178个ORF2基因序列。全基因组序列、ORF1和ORF2基因的同源性分别为93.9%-99.9%、96.6%-100%和86.8%-100%;氨基酸比对表明Rep蛋白主要存在12个氨基酸变异位点,Cap蛋白主要存在55个氨基酸变异位点,表明Cap蛋白具有很高的遗传变异特性。重组分析表明,不同的PCV2毒株在猪体内可以发生重组,产生新的毒株。遗传进化分析表明,获得的PCV2毒株序列中,15个为PCV2a基因型,58个为PCV2b基因型,169个为PCV2d基因型,表明目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。（2）通过全球毒株序列分析,确定了PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律和氨基酸变异规律,并分析了导致氨基酸变异可能的原因和影响。PCV2毒株进化过程中可视化的基因型漂移规律表明,世界范围内,2001年前,PCV2a为主要基因型,2001-2011年,PCV2b为主要基因型,2011年后,PCV2d为主要基因型;2006年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2a和PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2001年,PCV2a漂移至PCV2b,2012年,PCV2b漂移至PCV2d。在中国,2002年前,PCV2a为主要基因型,2002-2008年,PCV2b为主要基因型,2008年后,PCV2d为主要基因型;2004年后,PCV2d呈上升趋势,PCV2b呈下降趋势;PCV2进化过程中经历了两次基因型漂移,2002年,PCV2a漂移至PCV2b,2009年,PCV2b漂移至PCV2d。在PCV2毒株的进化过程中,Cap蛋白上14个氨基酸位点发生了明显的变异,发生时间在2007年左右,PCV2商品化疫苗在世界范围内使用时间为2006年,表明疫苗使用和免疫压力可能导致了氨基酸变异。由于2015年前使用的疫苗全部为PCV2a基因型,进一步分析PCV2a、PCV2b和PCV2d基因型的氨基酸组成,发现Cap蛋白氨基酸变异前主要由PCV2a和PCV2b基因型决定,变异后由PCV2d基因型决定,进一步说明疫苗的使用可能导致PCV2在进化过程发生氨基酸变异,而氨基酸变异则导致PCV2d基因型的出现和流行。（3）PCV2的分子流行病学调查结果表明,目前我国猪群流行的PCV2毒株以PCV2d基因型为主。为进一步确定PCV2的流行株,对PCV2d Cap蛋白氨基酸进行比对,发现PCV2/JL/JL19毒株Cap蛋白序列保守,与其它毒株比较没有氨基酸变异,所以将其确定为PCV2优势流行株。为明确PCV2/JL/JL19流行株的致病性,对病毒进行分离,病毒滴度可达106.0 TCID50/m L。猪体攻毒试验中,临床症状主要表现为食欲下降和背毛粗糙,攻毒后28天体重明显下降;临床剖检主要表现为淋巴结肿大和出血,各组织器官中均可检测到高拷贝数PCV2 DNA,产生明显的病毒血症;组织病理学观察腹股沟淋巴结和肺脏产生明显病理变化,这些结果表明目前PCV2流行毒株对猪体有明显的致病性。（4）为了解PCV3在我国的分子流行病学特征,对2016-2019年间,我国10省份278个猪场的4199份猪临床样本进行PCV3检测。PCV3在猪群中总阳性率为29.4%（1235/4199）,不同省份间阳性率为7.3%-37.3%;在猪场水平阳性率为74.8%（208/278）,表明PCV3在我国猪群中普遍存在。统计学分析表明PCV3可能增加PCV2和PRRSV感染率,并与猪的临床疾病相关。为进一步研究PCV3的遗传变异和进化规律,对部分检测阳性的临床样本进行全基因组序列扩增,共获得了70个PCV3全基因序列。同源性分析表明PCV3毒株具有很高的遗传稳定性,与其他圆环病毒有很大区别。通过对NCBI数据库中全部673个PCV3毒株序列分析表明,Cap蛋白主要氨基酸变异位点全部在预测的抗原表位上,并且在PCV3毒株进化过程中发生变异。遗传进化分析表明,PCV3毒株主要分为两个基因型,PCV3a和PCV3b;在PCV3的进化过程中PCV3a逐渐减少,PCV3b逐渐增多。上述结果为理解PCV3的流行,发病机制,进化规律和将来的防控提供理论基础。（5）流行病学调查结果表明,PCV3在猪群中具有很高的阳性率,除了猪之间的传播外,是否还存在其他潜在的传播途径,比如通过蚊等媒介生物传播。为了解PCV3在蚊子中的感染和基因组特征,对黑龙江,吉林和云南省的7个猪场的269份蚊子和80份猪血清样本进行PCV3检测。蚊子中PCV3的总阳性率为32.0%（86/269）,同一猪场的蚊子中PCV3阳性率和猪中PCV3阳性率呈正相关性,表明蚊子可能作为PCV3的传播载体。为了解蚊子中PCV3的起源和基因组特性,从蚊子中获得了6个PCV3全基因组序列,从猪中获得了2个PCV3全基因序列。序列分析表明,同一猪场的蚊子和猪中PCV3同源性为100%,表明蚊子中PCV3起源于猪。遗传进化分析表明,蚊子中PCV3分别属于PCV3a和PCV3b基因型。上述结果表明蚊子可能作为PCV3传播链中潜在的传播媒介。（6）对PCV2疫苗新兽药注册和临床试验分析表明,PCV2基因工程疫苗和以PCV2为基础的多联疫苗是PCV2疫苗的发展趋势。PCV3作为猪新发传染病,与PCV2同为圆环病毒科圆环病毒属成员,与猪的多种临床症状相关,给养猪业带来危害。以分子流行病学研究中获得的PCV2流行株PCV2/JL/JL19和PCV3流行株PCV3/JL/JL32的Cap氨基酸为参考,针对猪物种进行密码子优化,以腺病毒为载体,获得了单独表达PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap;和同时表达PCV2 Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap。经过测序表明,基因正确,Western Blot和IFA鉴定蛋白获得表达,稳定性实验表明3株重组腺病毒具有很好的稳定性,表明重组腺病毒构建成功。（7）小鼠免疫试验表明,重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫后35天,PCV2特异性抗体效价可达1:2700和1:2100;中和抗体分别为1:43和1:52;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.37倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。重组腺病毒r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap疫苗免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达1:2100和1:1600;淋巴细胞增殖水平均为对照组PBS的1.3倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。上述结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫小鼠后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答;重组腺病毒r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫小鼠后能够同时产生较好的针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答。（8）猪体免疫试验表明,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫后35天,PCV2特异性抗体效价均可达1:1300;中和抗体分别为1:85和1:81;淋巴细胞增殖水平分别为对照组PBS的1.46倍和1.4倍;均能够产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV2流行株PCV2/JL/JL19攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比无明显临床症状,能够减少病毒血症猪数量,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后35天,PCV3特异性抗体效价可达分别为1:1600和1:1300;淋巴细胞增殖水平均分别为对照组PBS的1.35倍和1.32倍;均能产生较高水平的细胞因子IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。PCV3组织毒攻毒后,重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV3-Cap和r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫组与对照组相比,能够减少PCV3病毒血症,肺脏和腹股沟淋巴结无明显病理变化。这些结果表明重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap和r Ad5-PCV3-Cap免疫猪体后能够分别产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,分别抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果;重组腺病毒疫苗r Ad5-PCV2-Cap-PCV3-Cap免疫猪体后能够同时产生较好针对PCV2和PCV3的体液和细胞免疫应答,同时抵抗PCV2和PCV3的攻击,为猪体提供很好的保护效果。