共刺激信号ICOSL/ICOS介导Th2极化与HSCs活化效应在血吸虫病肝纤维化形成中的作用

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由于血吸虫虫卵沉积导致的肝脏虫卵肉芽肿病变和继发性肝纤维化被认为是日本血吸虫病的重要病理损伤。研究表明,宿主在感染日本血吸虫的慢性致病过程当中,血吸虫可溶性虫卵抗原(Soluble egg antigen,SEA)介导的Th2极化在肝脏虫卵肉芽肿反应中的调节和诱发继发肝纤维化中发挥关键作用。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)的活化,使大量的细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)沉积在肝脏组织内是肝纤维化进程当中的关键环节。本研究中日本血吸虫病实验动物模型分别为:在FVB/NJ小鼠遗传背景的基础上构建的ICOS转基因(ICOS transgenic, ICOS-Tg)小鼠;并将FVB/NJ小鼠作为其野生型对照。探讨ICOSL/ICOS信号对感染宿主Th2型免疫应答、免疫病理及HSCs活化的影响,探究共刺激信号ICOSL/ICOS介导的Th2极化与HSCs的活化效应对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响,为开辟能有效的控制肝纤维化的新途径提供坚实的理论依据。本论文研究分四个部分:一、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中Th2极化相关共刺激分子表达动态变化目的:探讨共刺激信号ICOSL/ICOS在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后,对与Th2极化有密切联系的ICOS、CD28、CD154等共刺激分子表达的影响。方法:分别在日本血吸虫感染前0周和感染后4周(早期)、7周(急性病变期)、12周(慢性期),运用流式细胞术分析观察ICOS、CD28、CD154等共刺激分子在ICOS-Tg及其野生型小鼠脾CD4+T淋巴细胞上表达水平动态变化。采用免疫组织化学法体内同期观察感染小鼠不同病期肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上相关共刺激分子表达水平动态变化。结果:流式数据表明,感染小鼠脾CD4+T淋巴细胞上共刺激分子CD28表达水平自感染后4周开始升高(46.51%),感染后7周达到峰值(78.70%),感染后12周有所下降,但表达水平仍维持在较高水平(60.01%);而共刺激分子ICOS(38.77%)和CD154(30.53%)表达水平自感染后4周开始升高,感染后7周(ICOS:48.10%; CD154:50.74%)、12周(ICOS:57.90%; CD154:55.00%)仍处于逐渐升高趋势。免疫组织化学体内同期检测发现,共刺激分子ICOS、CD28、CD154在感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上的表达水平在感染后7周即处于较高水平(0.551;0.479;0.516, IOD/AOVI),感染后12周仍呈上升趋势(0.662;0.492;0.576, IOD/AOVI)。并且ICOS、CD28、CD154在ICOS-Tg小鼠脾CD4+T淋巴细胞上的表达水平均要高于同时期野生型小鼠(8.36~57.90vs5.51~41.21;27.33~60.01vs22.36~51.43;5.80~55.0vs4.73~41.21,%);其在肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上的表达水平在感染后7周(0.551vs0.355;0.479vs0.349;0.516vs0.432, IOD/AOVI)、12周(0.662vs0.418;0.492vs0.431;0.576vs0.447,IOD/AOVI)亦高于同时期野生型小鼠。结论:在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中,与Th2极化密切相关的共刺激分子ICOS、CD28、CD154的表达均呈逐渐上升趋势,特别是ICOS表达更为显著并可能影响相关共刺激分子CD28和CD154的表达。二、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主Th2极化的作用目的:探讨ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后,上调ICOSL/ICOS信号对宿主体内Th2极化的影响。方法:分别收集ICOS-Tg及其野生型小鼠感染前0周和感染后4周、7周、12周的脾淋巴细胞,收集经SEA刺激培养72h后的细胞上清,运用ELISA双抗夹心法检测观察上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12和Th2型细胞因子IL-4、IL-13的表达水平动态变化。结果:感染小鼠脾细胞培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12表达水平自感染后4周开始升高(38.98pg/ml;73.50pg/ml),感染后7周达到峰值(62.40pg/ml;119.96pg/ml),感染后12周表达下调(33.02pg/ml;93.36pg/ml),表明病程由急性期转为慢性期时,Th1型细胞因子的表达水平下调;而Th2型细胞因子IL-4、IL-13表达水平自感染后4周开始升高(11.49pg/ml;66.94pg/ml),感染后7周(23.04pg/ml;165.82pg/ml)、12周(41.89pg/ml;208.66pg/ml)呈上升表达趋势。Th2型细胞因子IL-4、IL-13在ICOS-Tg小鼠培养上清中的表达水平均要高于同时期野生型小鼠(3.98~41.89vs3.89~28.82;19.56~208.66vs15.49~165.38, pg/ml)。结论:在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中,上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的Th2型细胞因子的表达,进而增强Th2极化免疫应答反应。三、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主肝脏纤维化的作用目的:探讨ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后,上调ICOSL/ICOS信号对宿主肝脏纤维化的影响。方法:分别收集ICOS-Tg及其野生型小鼠感染前0周和感染后4周、7周、12周的血清,应用ELISA双抗夹心法检测血清中羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)含量并观察其动态变化规律。采用Masson染色法观察感染小鼠不同病期肝脏纤维化程度的变化。运用免疫组织化学法体内同期检测观察Collagen-Ⅰ、α-SMA和TGF-β1等蛋白在感染小鼠不同病期肝组织中的表达水平动态变化。结果:随着病程的迁移,感染小鼠血清中HYP、HA的表达水平自感染后4周呈逐渐上升趋势(1.61~2.93, μg/ml;211.49~284.50, ng/ml;),肝脏纤维化程度加重,肝脏中Collagen-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1蛋白的表达水平亦逐渐上调(0.013~0.518;0.022~0.587;0.069~0.510, IOD/AOVI)。而HYP(1.61~2.93vs1.54~2.21,μg/ml)、HA(152.74~284.50vs145.97~224.93, ng/ml)在ICOS-Tg小鼠血清中的表达水平均要高于同时期的野生型小鼠;并且Collagen-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1等蛋白在ICOS-Tg小鼠肝组织中的表达水平在感染后7周(0.463vs0.332;0.550vs0.443;0.483vs0.312, IOD/AOVI)、12周(0.518vs0.374;0.587vs0.451;0.510vs0.356,IOD/AOVI)亦高于同时期的野生型小鼠。结论:在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中,上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的肝脏纤维化的形成。四、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主HSCs活化效应及肝纤维化的作用目的:探究ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后,上调ICOSL/ICOS信号对宿主HSCs活化及肝纤维化形成的影响。方法:采用肝脏酶灌注充盈法和密度梯度离心法分离出感染前(0周)和感染早期阶段(4周、6周)、感染急性病变期(9周)ICOS-Tg及其野生型小鼠原代HSCs,运用台盼蓝拒染法鉴定分离的原代HSCs成活率;采用其在328nm波长紫外激发光下自发荧光特性和其在肝细胞中特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定分离的原代HSCs纯度;原代HSCs培养7d后,用Trizol Reagent试剂抽提总RNA;利用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR)SYBR法检测Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1等基因的表达水平变化,观察HSCs的活化效应及对肝纤维化进程的调节作用。结果:分离的原代HSCs纯度达到90%,其成活率为95%,原代培养过程中细胞状态良好。随着病程的迁移,HSCs的活化程度逐渐增加,HSCs中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1等基因的表达水平逐渐上调(0.621~1.093;0.312~0.576;0.706~1.078;0.760~1.138,gene/β-actin)。ICOS-Tg小鼠与HSCs活化相关基因α-SMA(0.706~1.078vs0.695~0.947, gene/β-actin)的表达均高于同时期野生型小鼠;ICOS-Tg小鼠HSCs中Collagen-Ⅰ(0.621~1.093vs0.583~0.832,gene/β-actin)、 Collagen-Ⅲ(0.312~0.576vs0.309~0.446, gene/β-actin)、TGF-β1(0.760~1.138vs0.732~0.919, gene/β-actin)等基因的表达水平亦高于同时期的野生型小鼠。结论:在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中,上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的HSCs的活化和肝纤维化的形成。本研究结果表明,共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染后宿主的Th2极化及肝脏内HSCs活化具有重要的调节作用,并促进肝脏纤维化形成。ICOSL/ICOS信号的调控将可能作为下调或抑制血吸虫虫卵肉芽肿病变及肝纤维化进程的靶点。
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