乳腺癌是妇女中最常见的恶性肿瘤,目前的治疗方法包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗及生物治疗,但效果仍不理想。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)学说的提出为彻底根除癌细胞,治愈乳腺癌带来了希望。CSC是一群具有自我更新能力和不定向分化潜能的细胞,是肿瘤不断生长的根源,也是肿瘤发生、扩散、复发等过程中的“起始细胞”和“动力细胞”。乳腺癌中的CSC不仅对彻底治疗乳腺癌具有重要意义,与乳腺癌患者的预后也密切相关。本研究首先探讨了乳腺癌CSC新的标志物ALDH1和CD55表达在乳腺癌预后评估中的应用价值,然后应用微球体培养法和化疗法分别对小鼠乳腺癌细胞系4T1中的CSC在体外和小鼠体内进行了富集,得到了富含乳腺癌CSC的细胞群和富含乳腺癌CSC的小鼠模型,最后应用影响CSC微环境的药物小白菊内酯(Parthenolide,PTL)在体外和小鼠体内对CSC进行杀伤实验,为临床应用PTL治疗乳腺癌提供依据。本研究共分为三个部分:第一部分ALDH1和CD55表达在乳腺癌预后评估中的意义目的:探讨乳腺癌CSC新的标志物ALDH1或CD55表达与乳腺癌组织学类型、分级等疾病特征的关系,明确ALDH1和CD55表达在乳腺癌预后评估中的应用价值。方法:应用免疫组化法对65例随访5~8年的乳腺癌患者组织标本进行ALDH1和CD55表达检测。ALDH1表达于胞质,阳性表达细胞呈棕黄色,阴性表达细胞呈蓝紫色。选取1张切片中的3个代表性视野,均有ALDH1阳性表达细胞者判为ALDH1阳性标本。CD55表达于胞质和胞膜,强阳性表达细胞呈棕黄色,弱阳性表达细胞呈浅黄色,阴性表达细胞呈蓝紫色。CD55高表达标本为CD55强阳性表达细胞≥5%。据以上标准判定ALDH1阳性表达及CD55高表达标本,分析乳腺癌患者各临床疾病特征与CD55高表达及ALDH1阳性表达的关系。分析患者5年生存率与CD55高表达、ALDH1表达及其它临床疾病特征的相关性,利用Cox比例分析模型进行乳腺癌患者预后的单因素分析,进而行多因素非条件Logistic回归分析进一步筛选影响患者预后的独立危险因素。结果:1正常乳腺组织ALDH1表达为阴性或极弱阳性,乳腺癌组织标本中ALDH1的阳性表达率为24.6%(16/65);正常乳腺组织CD55为阴性或低表达。在乳腺癌组织标本中,高表达CD55的标本占33.8%(22/65)。2 ALDH1阳性表达和CD55高表达与乳腺癌患者绝经状况、肿瘤组织学类型、组织学分级、肿瘤直径、是否发生淋巴结转移、雌激素受体和孕酮受体表达情况、表皮生长因子受体2(her2)表达情况、术后是否接受其他治疗均无关(P>0.05);与患者治疗后的肿瘤复发密切相关(P<0.01)。3 ALDH1阳性、CD55高表达患者的5年生存率与ALDH1阴性、CD55低表达患者相比显著降低(P<0.001)。4 ALDH1表达、CD55高表达、肿瘤直径、组织学分级、her2表达阴性、术后未接受治疗6项因素与乳腺癌患者5年生存率有关,是影响乳腺癌患者预后的独立影响因素。结论:ALDH1阳性表达和CD55高表达与肿瘤复发密切相关,是影响乳腺癌患者预后的独立因素,但与乳腺癌患者其它疾病特征无关。第二部分小鼠乳腺癌细胞系4T1中CSC的体外富集及富含乳腺肿瘤CSC的动物模型制备目的:应用微球体培养法和化疗法分别对小鼠乳腺癌细胞系4T1的CSC在体外和小鼠体内进行富集,得到富含乳腺癌CSC的细胞群和富含乳腺癌CSC的小鼠模型,并对其特征进行研究,为进一步研究如何杀伤乳腺癌CSC奠定基础。方法:1 CSC微球体培养法:4T1细胞以2×104/mL接种于无血清培养基(SFM)中,静止培养3天,离心换液,当培养瓶中形成由100~200个细胞构成的细胞球后,用稀释的胰蛋白酶-EDTA消化传代,约6~7天传代一次。2富含乳腺癌CSC的荷瘤小鼠模型制备:4T1细胞悬液0.2ml(含有1.5×106个细胞)接种于小鼠右肩胛皮下,观察瘤块形成,直径达0.1cm左右时,给予小鼠0.2mg/ml的5-FU0.2ml,给药方式为腹腔注射,用药时间为每天一次,共用七天,七天后改为一周一次。四周后脱颈处死小鼠,无菌取小鼠肿瘤,以组织研磨器研磨制成细胞悬液,用PBS调整活细胞浓度为7.5×106/ml。重复以上操作制作第二代富集CSC的小鼠模型,共制作四代小鼠模型。3 CSC的检测:应用流式细胞仪检测CD44+CD24-/low细胞的含量,应用HOECHST33342染色法观察计数无荧光染色侧群(SP)细胞比例,应用荧光定量PCR法检测细胞耐药基因MDR1、BCRP、ALDH1 mRNA表达。应用免疫组化法检测肿瘤组织CD55和ALDH1的表达,无血清悬浮培养观察肿瘤组织细胞微球体形成效率。致瘤性检验验证富集的CSC成瘤性。结果:1 4T1细胞在SFM中可形成能够连续传代的细胞球,第10代微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞含量可达68.9±3.78%,侧群(SP)细胞比例为56.1±5.18%,MDR1、BCRP和ALDH1 mRNA表达与SSM培养4T1细胞对照相比分别上调了1.63±0.21倍、2.14±0.21倍和3.41±0.53倍。致瘤性检验表明,微球体细胞2×103个细胞即可在小鼠体内成瘤,而SSM培养的4T1细胞至少需要2×105个细胞才可成瘤。2利用化疗药5-Fu建立了富含乳腺癌CSC的小鼠模型。第三代小鼠模型肿瘤组织CD44+CD24-/low细胞比例可达69.0±1.6%,SP细胞比例为61.3±2.6%,与对照的肿瘤组织相比MDR1、BCRP和ALDH1 mRNA水平分别上调了4.35±0.21倍、6.14±0.47倍和3.78±0.32倍(P<0.01)。ALDH1表达为阳性,CD55强阳性表达细胞数为17.3±1.9%,明显强于对照肿瘤组织。致瘤性检验表明,接种模型组肿瘤组织2×103个细胞即可在小鼠体内成瘤,而对照肿瘤组织至少需要2×105个细胞才可成瘤。结论:利用无血清微球体培养在体外富集了乳腺癌细胞系4T1中假定的CSC,利用化疗药物制备了富含乳腺癌CSC的小鼠模型,通过多项指标检测及致瘤性检验证实,本实验富集CSC制备富含乳腺癌CSC的小鼠模型是成功的,为进一步研究靶向杀伤CSC奠定了基础。第三部分小白菊内酯杀伤小鼠乳腺癌肿瘤干细胞的研究目的:探讨小白菊内酯(Parthenolide,PTL)在体内和体外对乳腺癌CSC增殖及分化的影响,为临床应用PTL治疗乳腺癌提供依据。方法:1 PTL杀伤4T1细胞系中CSC的体外实验:无血清悬浮培养的第10代微球体细胞以SFM培养基培养,接种于25ml培养瓶(5×104/mL),25瓶细胞随机分为对照组、5-FU组、PTL组、5-FU+PTL组、PTL+NAC(N-乙酰半胱氨酸)组5组。对照组加入生理盐水20μl,5-FU组加入5-FU(0.1mg/ml) 20μl,PTL组加入PTL(1mg/ml)20μl,5-FU+PTL组加入5-FU(0.2mg/ml) 10μl和PTL(2mg/ml)10μl,PTL+NAC组加入PTL(2mg/ml)10μll和NAC(20mg/ml) 10μl。培养48小时后离心换液用SFM继续培养。7天后观察细胞的成球情况,收集细胞进行检测。2 PTL杀伤4T1细胞系中CSC的动物实验:雌性BALB/c小鼠共25只,抽签法随机分为对照组、5-FU组、PTL组、5-FU+PTL组、PTL+NAC组5组。无菌手术取经化疗法形成的第三代小鼠移植瘤,将肿瘤组织研磨制成细胞悬液,吸取0.2ml细胞悬液(含1.5×106个细胞)接种于小鼠皮下。接种24小时后对照组小鼠给予生理盐水0.4ml,分别为腹腔0.2ml,肩胛部肿瘤细胞接种部位0.2ml;5-FU组小鼠给予0.2mg/ml的5-FU0.4ml,PTL组小鼠给予1mg/ml的PTL0.4ml, 5-FU+PTL组小鼠给予含0.2mg/ml 5-FU和1mg/ml PTL的混合药物0.4ml,PTL+NAC组给予含1mg/ml PTL和10mg/ml NAC的混合药物0.4ml,给药部位和剂量与空白对照组相同。用药时间为每天一次,共用七天,七天后改为一周一次。四周后脱颈处死小鼠,取肿瘤进行检测。3 CSC的检测:应用流式细胞仪检测CD44+CD24-/low细胞的含量,应用HOECHST33342染色观察计数无荧光染色侧群细胞(SP)细胞比例,应用荧光定量PCR法检测细胞耐药基因MDR1、BCRP、ALDH1 mRNA表达。应用免疫组化法检测肿瘤组织CD55和ALDH1的表达。结果:1 PTL杀伤4T1细胞系中CSC的体外实验结果:经过5-FU、PTL、5-FU+PTL或PTL+NAC处理后用SFM培养,对照组、5-FU组、PTL+NAC组可形成明显的细胞球,PTL组形成的细胞球很少,仅有散在的细胞球存在,5-FU+PTL组存活细胞极少,细胞因凋亡而裂解。对照组、5-FU组、PTL组、PTL+NAC组形成的细胞球中CD44+CD24-/low细胞含量分别为71.2±2.3%、75.6±3.1%、12.3±1.9%、58.1±2.6%;无荧光染色细胞(SP)细胞百分比分别为56.7±3.4%、62.0±2.7%、8.1±1.1%、51.5±2.3%,PTL组CD44+CD24-/low细胞和SP细胞含量明显低于对照组、5-FU组和PTL+NAC组(P<0.01)。2 PTL杀伤4T1细胞系中CSC的动物实验结果:经过5-FU、PTL、5-FU+PTL或PTL+NAC治疗后,对照组、5-FU组小鼠形成肿瘤的速度和直径远大于PTL组、5-FU+PTL组、PTL+NAC组(P<0.01)。对照组、5-FU组、PTL组、5-FU+PTL组、PTL+NAC组各组小鼠肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞含量分别为57.3±4.1%、68.7±3.2%、42.5±3.7%、39.1±2.9%、50.1±3.1%,无荧光染色细胞(SP)细胞百分数分别为58.1±4.1%、61.3±2.6%、36.9±3.5%、39.2±1.8%、42.7±2.5%,PTL组、5-FU+PTL组、PTL+NAC组CD44+CD24-/low细胞和SP细胞含量明显低于对照组、5-FU组(P<0.05)。5-FU组、PTL组、5-FU+PTL组、PTL+NAC组与对照组相比,荷瘤小鼠肿瘤组织中MDR1相对基因表达量分别为1.11±0.11、0.92±0.12、1.03±0.15、0.94±0.08,各组间比较无统计学差异(P>0.05);BCRP相对基因表达量分别为1.09±0.16、0.97±0.10、1.13±0.11、0.95±0.13,各组间比较无统计学差异(P>0.05)。ALDH1相对基因表达量分别为1.16±0.12、0.38±0.07、0.42±0.09、0.57±0.04, PTL组、5-FU+PTL组、PTL+NAC组明显低于对照组和5-FU组(P<0.05)。结论: PTL可以靶向乳腺癌CSC,改变CSC的状态,使培养细胞或肿瘤组织CSC含量明显降低。抗氧化剂NAC体外实验中可以明显拮抗PTL这种作用,但在小鼠体内作用不明显。PTL与其它化疗药物联合应用,可增强其它药物的化疗效果,PTL可作为化疗增敏剂使用。