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目的:
从体外实验方面初步研究了茶氨酸对谷氨酸致体外原代培养神经细胞兴奋性损伤的保护作用剂量范围及其可能涉及的机理;通过建立大鼠脑缺血模型,初步研究了茶氨酸对脑缺血损伤的保护作用,并探索了其神经保护功能与氧化酶活性、自由基水平的关系。为茶氨酸进一步作为天然植物神经保护剂应用于神经保护提供科学依据。
方法:
1、茶氨酸对PC12细胞alamar blue还原率的影响:将培养2-3天的PC12细胞以3×10<5>/ml的密度接种于96孔板,每孔100μl,37℃,5%CO<,2>条件下培养3-5d,加入5-10000gmol·L<-1> 8个浓度梯度的茶氨酸工作液,同时设阴性对照和NaF损伤对照组继续培养24h,24h后换液一次,再加同样的受试物工作液培养24h后,加入alamar blue工作液测定细胞活力。
2、茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经细胞alamar blue还原率的影响:分离收获新生1-3天Wistar大鼠大脑皮层神经细胞,以3×10<5>/ml的密度共培养法接种于96孔板,每孔100pll,37℃,5%CO<,2>条件下培养第7天加入终浓度10μmol·L<-1>阿糖胞苷抑制非神经细胞的生长,取培养12-14d的细胞,加入50-10000μmol·L<-1>7个浓度梯度的茶氨酸工作液,同时设阴性对照组,继续培养24h,24h后换液一次,再加同样的受试物工作液培养24h后,加入alamarblue工作液测定细胞活力。
3、茶氨酸对Glu致原代培养大鼠大脑皮层神经细胞兴奋性损伤后细胞alamarblue还原率的影响:以上述方法培养大鼠原代大脑皮层细胞12-14d,加入5-1000μmol·L<-1>7个浓度梯度的茶氨酸工作液,同时设阴性对照组、Glu损伤组、mk801保护组,继续培养24h,24h后弃原培养基,所有保护组和Glu损伤组均加入终浓度为500μmol·L<-1>的谷氨酸Earli e’s液作用15-20min,然后再置换成等体积的保护剂工作液,其中阴性和Glu损伤对照组只加不完全培养基,继续培养24h后,加入alamar blue工作液测定细胞活力。
4、茶氨酸对G1u致原代培养大鼠大脑皮层神经元兴奋性损伤后细胞上清中μLDH漏出量和NO释放量的影响:在六孔板中分离式原代培养大鼠大脑皮层神经元,待神经元生长到7-10d时,分别加入5、10、100μmOL·L<-1>3个浓度梯度的茶氨酸工作液,同时设阴性对照、Glu损伤对照、mk801保护对照组,每组6孔细胞,培养24h,24h后弃原培养基,所有保护组和Glu损伤组均加入终浓度为500μmol·L<-1>的谷氨酸Earlie’s液作用15-20min,然后再置换成等体积的保护剂工作液,其中阴性和Glu损伤对照组只加不完全培养基,继续培养24h后取上清,全自动生化分析仪测定细胞上清中LDH含量、化学法测定NO含量。
5、茶氨酸对Glu致原代培养大鼠大脑皮层神经元兴奋性损伤后细胞内nNOS、Caspase-3表达量的影响:按上述方法6孔板分离式原代培养大鼠大脑皮层神经元7-10d,加受试物作用48h后,取出生长有神经元的玻片,按照免疫组化三步法步骤DAB染色测定神经元内nNOS、Caspase-3表达量,最后用image proplus5.2对细胞着色深浅进行分析。
6、取4周龄体重90-100g SD大鼠30只,按体重随机区组分为5组,每组6只:缺血模型组、假手术组、茶氨酸保护低(4.2mg/kg.BW)、中(8.3 mg&g.BW)、高(16.6 mg/kg.BW)剂量组。动物每天灌胃给予一次受试物,对照组给予蒸馏水连续给予21d;末次给药后,进行单侧颈动脉插线法制备永久性局灶性脑缺血模型,术后24h观察动物体征并进行神经功能学评分,然后断头处死动物,取缺血侧大脑半球,称湿重,然后制备0.1%脑匀浆,3500r/min 4℃离心15min,取上清依次测定MDA、NO含量及GSH-px、ATP酶活性等指标。
结果:
1、各剂量茶氨酸作用于受试细胞后,1000μmol·L<-1>以下剂量茶氨酸组细胞对alamar blue还原率均与阴性对照组无显著差异,只有1000μmol·L<-1>及以上茶氨酸剂量组细胞对alamarblue还原率与阴性对照组相比有所下降。
2、与阴性对照组相比,Glu损伤组细胞对alamarblue还原率显著降低;而5-1000pmol·L<-1>剂量的茶氨酸保护组细胞对alamar blue还原率均与阴性对照组无显著性差异,其中10-500μmol·L<-1>剂量的茶氨酸保护组细胞对alamar blue还原率显著高于Glu损伤组。
3、与阴性对照组相比,Glu损伤组细胞培养液上清中LDH含量有所增高,NO含量显著增高;而各保护组细胞培养液上清中LDH、NO含量与阴性对照组相比均无显著性差异,与Glu损伤组相比均有所增高。
4、与阴性对照组相比,Glu损伤组细胞内nNOS、Caspase-3表达量显著增高,各保护组细胞内nNOS、Caspase-3表达量都显著低于Glu损伤组。
5、茶氨酸处理组脑缺血大鼠神经功能缺陷评分结果显著低于缺血模型组。茶氨酸低中剂量组脑半球湿重显著低于缺血模型组。
6、茶氨酸各处理组大鼠脑匀浆上清液中NO、MDA含量均与缺血模型组无显著性差异,但是从数值上看各茶氨酸处理组NO、MDA含量均有小于缺血模型组的趋势。
7、假手术组大鼠脑匀浆上清液中GSH-px及ATP酶活性高于缺血模型组。低剂量茶氨酸组酶活性显著高于缺血模型组,各茶氨酸处理组酶活性结果在数值上均有高于缺血模型组的趋势。
结论:
1.体外实验显示1000μmol·L<-1>剂量以下的茶氨酸对体外培养PC12及大鼠原代皮层神经细胞都没有可观察到的毒性:5-500gmol·L<-1>剂量的茶氨酸均具有拮抗谷氨酸毒性的作用,其适宜的作用剂量范围为10-100μmol·L<-1>。
2.5-100μmol·L<-1>剂量的茶氨酸在体外可以显著降低谷氨酸损伤后神经细胞培养液上清中的NO水平、降低细胞的LDH漏出率、减少细胞内nNOS及Caspase-3的表达。体外实验提示,茶氨酸对神经细胞的保护作用与其拮抗谷氨酸的毒性有关,其作用机制涉及兴奋性氨基酸对神经细胞损伤的多个位点。
3.体内实验提示茶氨酸对大鼠脑缺血模型具有明显的保护作用,它可以显著减轻大鼠脑缺血后神经功能缺陷症状、降低脑水肿程度;并可以在一定程度上降低脑组织内自由基水平,并提高氧化酶的活性。体内实验进一步佐证了体外实验的部分研究结果。