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目的: 1、研究叶绿酸对反式-7,8-二羟-9，10-环氧苯并芘(反式-BPDE)恶性转化人支气管上皮细胞系16HBE体外生长及细胞周期影响。2、探索叶绿酸抗反式-BPDE诱导细胞恶变的分子机制，初步阐明其可能的细胞周期相关基因及蛋白分子调控途径。3、探索反式-BPDE和结晶型硫化镍致癌过程中线粒体DNA(mtDNA)高变区序列是否改变，同时也观察叶绿酸抗细胞恶变中是否涉及线粒体DNA高变区序列的变化。
方法: 1、将前期实验中冻存的16HBE细胞和反式-BPDE处理的第25代恶性转化细胞和经100μmol/L叶绿酸抗BPDE恶性转化细胞模型进行复苏，采用MTT方法检测比较其各组细胞生长增殖活力，并绘制各组细胞生长曲线。
2、采用流式细胞仪(FCM)进行细胞周期和细胞凋亡分析。
3、应用RT-PCR技术检测各组细胞中抑癌基因E-cadherin的mRNA水平表达。
4、应用荧光免疫细胞化学技术检测各组细胞中细胞周期相关蛋白cyclinD1、cyclinE及抑癌基因E-cadherin的表达水平和分布。
5、采用PCR-SSCP技术和克隆测序方法分析反式-BPDE、硫化镍恶变细胞及叶绿酸抗恶变细胞中mtDNA高变区序列。
结果: 1、细胞生长曲线及增殖活力检测在保证培养条件、接种细胞量、观察时间一致的情况下，4组细胞之间总体生长趋势有差异(F=657.034，P＜0.01)，以反式-BPDE恶性转化细胞组变化最显著，其增殖速度及存活能力比对照组16HBE明显增高(P＜0.01)。经100μmol/L叶绿酸抗BPDE恶性转化细胞组(CHL+BPDE)细胞增殖速度及存活能力较单独BPDE恶性转化细胞组降低(P＜0.05)。经同样浓度叶绿酸处理的正常细胞16HBE(CHL组)与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，两组细胞生长曲线差异无显著性。
2、细胞周期分布及凋亡检测叶绿酸在BPDE恶性转化16HBE细胞中使G0/G1期细胞周期比例提高。对照组16HBEG0/G1期细胞为65.91％，S期为12.66％。经0.5μmol/LBPDE恶性转化的16HBE细胞组G0/G1期细胞百分比降至45.86％，S期细胞增加为37.75％。两组相比差异有显著性(P＜0.05)。而经100μmol/L的叶绿酸抗转化细胞组G0/G1期细胞百分比增至68.01％，S期下降为25.62％，与单用BPDE转化细胞组相比差异有显著性(P＜0.05)。与之对应，经同样浓度叶绿酸处理的正常16HBE细胞组其G0/G1期细胞百分比为64.12％，与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。各细胞组均未见凋亡标志的亚G1峰。
3、抑癌基因E-cadherin的检测分析应用RT-PCR方法分析各组细胞mRNA表达水平变化，发现BPDE转化细胞及成瘤细胞均出现E-cadherin基因表达几乎丢失现象，而叶绿酸抗转化细胞组E-cadherin基因表达正常。阳性对照组NCIH460大细胞肺癌细胞E-cadherin基因表达完全丢失。经荧光免疫细胞化学技术从蛋白水平证实上述的现象。
4、荧光免疫细胞化学技术检测相关细胞周期蛋白表达经荧光免疫细胞化学方法检测正常对照组16HBE细胞、BPDE恶性转化细胞、叶绿酸抗转化细胞三组中细胞周期素cyclinD1、cyclinE的表达量及分布情况，发现BPDE诱发16HBE恶性转化细胞具有cyclinD1、cyclinE的高表达，而经叶绿酸抗转化组细胞有cyclinD1、cyclinE表达下调效应。
5、经PCR-SSCP技术和克隆测序方法分析所有组细胞均未发现mtDNA高变区序列的异常改变。
结论: 1、对正常细胞无影响的一定浓度叶绿酸有抑制反式-BPDE恶性转化人支气管上皮细胞增殖活性的作用。
2、叶绿酸具有通过提高恶性转化细胞G0/G1期细胞周期比例影响细胞周期的进程及改变恶性细胞的增殖和分化作用。
3、反式-BPDE恶性转化细胞和成瘤细胞均出现E-cadherin基因表达丢失，而叶绿酸抗转化细胞并没表现出异常变化，其抗癌机制可能与E-cadherin基因表达及功能是否正常有关。
4、叶绿酸具有下调由反式-BPDE诱发16HBE恶性转化细胞高表达cyclinD1、cyclinE的效应，提示叶绿酸调节细胞周期素表达改变可能是其拮抗BDPE致癌机制之一。
5、反式-BPDE诱导转化与成瘤的16HBE细胞、结晶型NiS诱导转化及成瘤的16HBE细胞、叶绿酸抗转化细胞、结晶型NiS急性染毒16HBE细胞及叶绿酸抗NiS急性染毒16HBE细胞的mtDNA高变区序列经多种方法反复检测均未发现异常改变，其致癌机制可能不涉及mtDNA高变区序列变化。而mtDNA高变区序列稳定性维持不是叶绿酸抗细胞恶变的作用机制。