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宫颈癌是全球范围内最常见的妇科生殖系统恶性肿瘤之一,给女性健康带来了严重的生理及心理负担。不同国家及地区宫颈癌发病情况存在差异。研究数据显示,我国宫颈癌年新发病例数约98,900例,死亡病例约30,500例,高于世界发达国家水平。高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomaviruse,HR-HPV）持续感染是引发宫颈癌的确切因素,其中以HPV-16与HPV-18两型最常见。目前,宫颈脱落细胞学和HPV DNA检测是临床筛查宫颈癌的主要手段,但这两种方法均存在局限性。细胞学检查灵敏度较低,且存在一定假阴性率;而HPV DNA检测虽灵敏度较高,但特异性较差,不能确定HPV感染后宫颈病变情况进展的风险。因此,目前急需寻找能够精准预测宫颈病变发展趋势的早期指标,从而能在病毒持续感染者中准确筛检出发生宫颈癌的高危患者,达到宫颈癌精准防治的要求。随着对宫颈癌发病机理的深入研究,DNA甲基化在肿瘤形成过程中的作用逐渐被认知。前期研究已经证实HPV-16 L1基因甲基化水平与宫颈病变关系密切。但是,对于HPV-16长调控区（long control region,LCR）甲基化状态的研究,结论具有争议性。HPV-16 LCR区包含四个具有相同回文结构的E2蛋白结合位点（E2 binding site,E2BS）。研究发现,E2蛋白通过与不同E2BSs位点结合,对E6/E7癌基因的表达发挥转录激活或抑制的双重功能。然而,E2BSs位点甲基化状态发生改变,可能抑制E2蛋白与E2BSs位点结合,进而干扰E2蛋白对E6及E7癌基因的调控作用,导致肿瘤的发生。本研究中,采用焦磷酸测序技术定量检测HPV-16 LCR区四个E2BSs位点甲基化水平,研究不同E2BSs位点甲基化状态与宫颈病变间关系,为能够精准筛选出宫颈癌早期诊断指标打下理论基础。材料与方法1研究对象标本收集于2016年7月至2017年3月在河南省妇幼保健院进行常规宫颈脱落细胞学检查的女性,入组病例共578例（年龄18-81岁,中位年龄37岁）。细胞学结果由我院细胞室3名专业的细胞病理医生根据2014 TBS系统分级法进行报告。标本感染HPV的型别由PCR杂交分型法进行检测,选取HPV-16单一型感染者样本作为研究对象。追踪HPV-16单一型感染者组织学结果,最终确定纳入本研究的标本共59例（年龄25-65岁,中位年龄37岁）。其中,18例HPV-16无症状感染者为对照组,18例低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL）样本,17例高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL）样本以及6例宫颈鳞癌（squamous cell carcinoma,SCC）样本。本研究经医院生命科学伦理委员会审批通过,患者知情同意并签署同意书。2方法2.1引物设计在genebank中查询HPV-16基因编号为NC001526.4,确定LCR区四个E2BSs位点所在序列;运用PyroMark Assay Design 2.0软件进行引物设计,筛选出3对PCR扩增引物及3条测序引物,并用生物素在其中一条扩增引物的5’端进行标记。2.2焦磷酸测序亚硫酸盐溶液对样本DNA进行转化,经甲基化PCR,样品中每个CpG位点的甲基化水平可由焦磷酸测序仪及Pyro Q-CpG软件自动分析定量检测。2.3 bDNA检测剩余样品中HPV E6/E7 mRNA表达水平采用Quantivirus?HPV E6/E7 RNA3.0 assay（bDNA）法检测。3统计分析SPSS21.0统计软件对数据进行分析。E2BSs位点甲基化水平、E6/E7 mRNA表达水平及组织病变级别间相关性采用Spearman秩相关分析;非参数检验进行组间比较;ROC曲线评价E2BSs位点甲基化水平对HSIL+（HSIL和SCC）诊断的敏感度与特异性。检验水准α=0.05。结果1.每例样本均成功检测HPV-16 LCR区域8个CpG位点甲基化状态;HSIL+组中,8个CpG位点甲基化水平均高于HPV-16无症状感染组（P均<0.05）;与其它CpG位点相比,7100位点在三组内甲基化状态均处于较高水平,而7073位点甲基化状态均处于较低水平。2.E2BSs位点甲基化水平与宫颈病变间均呈正相关（rs分别=0.614,0.599,0.289,0.502;P均<0.05）;E2BS1、E2BS2及E2BS4位点甲基化水平在HSIL+组显著高于HPV-16无症状感染组与LSIL组（P均<0.05）;E2BS2和E2BS1位点甲基化水平在HPV-16无症状感染组与LSIL组间差异具有显著性（P均<0.05）,但E2BS4位点甲基化水平在两组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3.HSIL+组与LSIL组,E2BS3位点甲基化水平均最低（P均<0.05）,且E2BS1位点甲基化水平均高于E2BS4位点（P均<0.05）;四个E2BSs位点甲基化水平在HPV-16无症状感染组内比较,差异不显著（P>0.05）。4.HPV E6/E7 m RNA水平随着E2BSs位点甲基化水平增加而增加（rs分别=0.480,0.467,0.290,0.302;P均<0.05）;其中,E6/E7 mRNA表达水平与E2BS1、E2BS2位点甲基化状态呈中度相关。5.ROC曲线显示E2BS1和E2BS2位点AUC较大,为0.791和0.806,95%CI分别为0.668-0.914和0.680-0.931（P均<0.05）;E2BS1和E2BS2位点甲基化水平诊断HSIL+病变敏感性均为73.9%,特异性分别为72.2%和80.6%。结论1.HPV-16 E2BSs位点甲基化状态可参与E2蛋白对E6/E7癌基因的转录调控作用。2.HPV-16 E2BSs位点甲基化水平与宫颈病变级别存在相关性,甲基化改变可能引起宫颈癌的发生。3.HPV-16 E2BS1和E2BS2位点甲基化状态有望成为临床预测宫颈病变进展的早期分子诊断指标。