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第一部分Honokiol改善大鼠颅脑创伤后神经功能障碍的实验研究目的：探讨Honokiol是否对颅脑创伤后神经功能障碍具有改善作用；同时,明确Honokiol治疗创伤性脑损伤的合适剂量,为其潜在的临床应用提供依据。方法：1.将50只SD大鼠随机分为5组(每组10只)：假手术组(sham组),颅脑损伤组(TBI组),Honokiol 0.5mg组,Honokiol 1.0mg组,Honokiol 2.0mg组。sham组大鼠仅仅模拟假性颅脑损伤,其余各组采用TBI-0310颅脑损伤仪制作标准的CCI中度颅脑损伤模型；对于sham组和TBI组,在创伤后第一天的第8h和16h经尾静脉给予相同容量的Vehicle(供溶解Honokiol用),之后每天一次在早晨8时给予相同容量的Vehicle,共计给药5天,而各Honokiol组则按前述给药方式给予相应剂量的Honokiol。并在TBI后第1、3、7、14、21天采用mNSS评分法对各组大鼠脑创伤后神经功能缺失情况进行评估△。2.取30只SD大鼠随机分为5组(每组6只),分组和处理方式同上,但是,对于各剂量Honokiol组,仅在伤后的第一天的第8h和16h给药两次,各组大鼠在脑损伤后24h获取脑组织,采用干湿重法测定脑组织含水量。3.取30只SD大鼠随机分为3组(每组10只)：sham组,TBI组,Honokiol 1.Omg组(简称Honokiol组,根据量效关系确定的合适剂量),造模和给药方案同方法1。并分别于1、3、7、14、21天进行Beam WalK Test试验,15、16、17、18、19天进行Morris Water Maze (MWM水迷宫)试验。结果：1. mNSS评分结果显示,与Sham组比较,TBI造成明显的神经功能缺失。给予Honokiol治疗后第一天,各剂量组不能减轻其神经功能缺失程度。与TBI+Vehicle组比,Honokiol 0.5mg组在3、7、14天能减轻神经功能缺失,Honokiol 1.Omg组在3、7、14、21天均能减轻TBI大鼠的神经功能缺失,而Honokiol 2.0mg组在3、7、21天能减轻TBI大鼠的神经功能缺失。各剂量组之间比较,Honokiol 1.0mg组与Honokiol 0.5mg组和Honokiol 2.0mg比,差异具有统计学意义,显示更好的神经功能保护作用。2.与Sham组比较,TBI导致脑含水量明显增加,而给予Honokiol治疗,各剂量组均能减轻脑含水量。但是,Honokiol 1.Omg组与Honokiol 0.5mg组和Honokiol 2.0mg组比,差异具有统计学意义,显示更好的减轻脑水肿作用。3. Beam WalK Test结果显示,与Sham组比较,TBI造成明显的运动功能障碍,而给予Honokiol治疗,能明显改善其运动功能障碍。与TBI+Vehicle组比较,Honokiol在3、7、14、21天能减轻TBI大鼠的运动功能障碍。Morris Water Maze试验显示,与Sham组比较,在Spatial learning测试中,TBI导致明显的空间学习功能障碍,而给予Honokiol治疗,能明显改善其学习功能障碍。与TBI+Vehicle组比较,Honokiol在16、17、18天能减轻TBI大鼠的空间学习功能障碍；而在Probe trial测试中,TBI造成明显的参考记忆功能障碍,与TBI+Vehicle组比,给予Honokiol治疗,能明显改善其记忆功能障碍。结论：Honokiol能减轻TBI后大鼠神经功能缺失和脑水肿,而且,1.Omg/kg的Honokiol为本次试验中合适的治疗剂量,同时,Honokiol能改善TBI后大鼠的运动功能和认知功能障碍。第二部分Honokiol减轻大鼠颅脑创伤后的病理损害及抑制神经元凋亡的实验研究目的：观察Honokiol对颅脑创伤后脑组织病理损害及神经元变性凋亡的影响,探讨其对脑创伤后神经元是否具有保护作用。方法：1.取30只SD大鼠随机分为3组(每组10只)：sham组,TBI组,Honokiol 1.Omg组,sham组大鼠仅模拟假性颅脑损伤,其余各组采用TBI-0310颅脑损伤仪制作标准的CCI中度颅脑损伤模型。对于sham组和TBI组,在创伤后第一天的第8h和16h经尾静脉给予相同容量的Vehicl,之后每天一次在早晨8时给予相同容量的Vehicle,共计给药5天。而Honokiol组则按前述给药方式给予相应剂量的Honokiol。在伤后/假手术后第21天获取脑组织标本,采用H-E染色法对脑损伤体积进行评估。2.取30只SD大鼠随机分为3组(每组10只)：分组和造模及给药方案同前,在伤后/假手术后第21天获取脑组织标本,采用Nissl染色法对皮质创伤灶周围和海马CA1区神经元缺失情况进行评估。3.取24只SD大鼠随机分为3组(每组8只)：分组和造模同前,但对于Honokiol组,仅在伤后第一天的第8h和16h给药两次,在脑创伤/假手术后24h获取脑组织标本,采用FJ-B标记法对皮质创伤灶周围和海马CA1区神经元变性情况进行评估。4.取24只SD大鼠随机分为3组(每组8只)：分组和造模同前,但对于Honokiol组,在伤后第一天的第8h和16h给药两次,随后每日给药一次,共计给药3天,在伤后/假手术后第3天获取脑组织标本,采用NeuN+Tunel免疫荧光双标技术对皮质创伤灶周围和海马CA1区神经元凋亡情况进行评估。结果：1.与TBI+Vehicle组(36.79+1.13 mm3)比较,大鼠TBI给予Honokiol治疗(21.37±1.01 mm3),能明显减轻TBI造成的脑组织缺损(P<0.05)：线性回归分析提示,其减轻脑组织缺损与在Beam Walk Test测试中改善其运动功能具有高度相关性(r2=0.93；P<0.0001)。2.TBI造成大鼠皮质创伤灶周围(62.84±4.22 vs 206.39±1.91 in sham组)和海马CA1区(76.19±4.21 vs 185.97±1.88 in sham组)明显的神经元缺失,与TBI+Vehicle组比,大鼠TBI后给予Honokiol治疗,能明显减轻TBI造成的皮质(145.14±2.59)和海马CA1区(136.76±2.53)神经元丢失；线性回归分析提示,其增加海马CA1区神经元的存活与在Morris Water Maze实验中改善其学习功能具有高度相关性(r2=0.94；P<0.0001)。3.TBI造成大鼠皮质创伤灶周围(110.70-4.72)和海马CA1区(134.95±8.63)明显的神经元变性,与TBI+Vehicle组比,大鼠TBI后给予Honokiol治疗,能明显减轻TBI造成的皮质(33.28±1.88)和海马CA1区(59.74±6.50)神经元变性(P<0.05)。4.TBI诱发大鼠皮质创伤灶周围(37.13±1.94%)和海马CA1区(60.01±3.18%)明显的神经元凋亡,与TBI+Vehicle组比,大鼠TBI后给予Honokiol治疗,能明显减轻TBI造成的皮质(12.11±1.16%)和海马CA1区(19.12±1.67%)神经元凋亡。结论：Honokiol能显著减轻TBI后大鼠脑损伤体积,增加皮质创伤灶周围和海马神经元存活数；Honokiol也能明显减少皮质创伤灶周围和海马神经元的变性和凋亡；Honokiol对神经元的这种保护作用有利于改善颅脑损伤后大鼠的神经功能障碍。第三部分Honokiol对大鼠颅脑创伤后神经元细胞周期活化的影响目的：观察大鼠颅脑损伤后细胞周期的活化情况以及Honokiol对大鼠颅脑损伤后神经元细胞周期活化的影响,探讨Honokiol抑制大鼠颅脑损伤后神经元凋亡的潜在机制。方法：1.对于每个待研究的细胞周期蛋白,取12只SD大鼠随机分为2组(每组6只)：sham组和TBI组,sham组大鼠仅模拟假性颅脑损伤,TBI组造模同前,在第1、3、7、14、21天获取脑组织标本,采用Western-Blot法测定颅脑损伤/假手术后脑组织周期蛋白的表达情况。2.对于每个待研究的细胞周期蛋白,取18只SD大鼠随机分为3组(每组6只)：sham组,TBI+Vehicle组,Honokiol 1.Omg组,造模和给药方式第二部分,根据上述研究得出的细胞周期蛋白表达变化的峰值时间点决定给药总时间,第一天为两次(间隔时间同前),之后为每日一次,最多给药5天；在相应的时间点获取脑组织标本,采用Western-Blot法观察Honokiol对细胞周期蛋白表达的影响。3.取24只SD大鼠随机分为3组(每组8只)：分组和造模同前。对于Honokiol组,在伤后给药3天(方式同前),在颅脑损伤/假手术后3天获取脑组织标本,采用免疫荧光双标法观察Honokiol对脑创伤后神经元细胞周期蛋白Cyclin D1和E2F1表达的影响及细胞周期蛋白与神经元凋亡关系的影响。结果：1.颅脑损伤后细胞周期相关蛋白Cyclin D1, CDK4, pRb(Ser780)和E2F1表达升高,而p27表达降低,Cyclin D1和E2F1在第3天达峰值,pRb (Ser780)在第1天达峰值,CDK4在伤后进行性升高直达21天,p27则在伤后第3天降到最低值,直到第21天仍未完全恢复。2.颅脑损伤后给予Honokiol治疗,能显著降低脑损伤后细胞周期蛋白Cyclin D1, CDK4, pRb(Ser780)和E2F1的活化程度,同时也能升高内源性细胞周期抑制性蛋白p27的表达。3.颅脑损伤后神经元出现Cyclin D1和E2F1的表达升高,同时大部分表达这些细胞周期蛋白的神经元出现凋亡,而这些异常改变在给予Honokiol治疗后,被明显抑制。结论：颅脑损伤后出现细胞周期的异常激活与颅脑损伤后神经元的凋亡及神经功能障碍有关,而Honokiol治疗能抑制大鼠颅脑损伤后神经元细胞周期的异常激活和因此而导致的神经元凋亡,可能是其改善大鼠颅脑创伤后神经功能障碍的潜在机制。