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芽孢杆菌和链霉菌属革兰氏阳性菌,具有相对简单的遗传物质和与发育分化相关的形态特征,它们独特的生物学特性使其成为了原核生物发育分化研究的模式材料。本论文以低G+C含量的苏云金芽孢杆菌和高G+C含量的天蓝色链霉菌为材料进行了以下两部分的研究工作:
第一部分:对苏云金芽孢杆菌芽孢形成相关基因-pdaA进行了功能研究。采用经典的遗传学方法构建了苏云金芽孢杆菌部分基因组文库,从中克隆到一个大小为2.8 kb的DNA片段。实验结果表明,从苏云金芽孢杆菌中克隆到的pdaA基因与蜡状芽孢杆菌,炭疽芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的多糖去乙酰化酶基因有很高的同源性。pdM基因的阻断不影响营养期芽孢杆菌的生长和产孢,但是明显影响芽孢的正常萌发。当以L-丙氨酸为诱导物时,pdaA阻断突变株在相差显微镜下呈浅灰色,OD600值下降明显未达到相同情况下野生型降低程度。pdaA基因阻断突变株在诱导萌发时停滞在此阶段,不能正常萌发。投射电子显微镜观察发现pdaA突变株芽孢皮层与野生型明显不同,推测pdaA基因突变表型是由于皮层中缺乏δ-内酰胺胞壁酸结构导致的。将野生型pdaA基因重新导入阻断突变株能恢复芽孢萌发,说明该突变表型确实而且只由pdaA基因造成的。RT-PCR分析表明在苏云金芽孢杆菌中,pdaA基因是在芽孢形成时期以单顺反子形式转录的。
对苏云金芽孢杆菌芽孢萌发相关基因-sleB进行了功能研究。采用经典的遗传学方法构建了苏云金芽孢杆菌部分基因组文库,从中克隆到一个大小约为4 kb的DNA片段。经序列分析表明,该片段含有四个完整的开放阅读框,其中包括完整的sleB基因。该基因编码的蛋白与蜡状芽孢杆菌,炭疽芽孢杆菌的皮层水解酶有很高同源性。采用双交换同源重组策略,在sleB基因内部插入一个红霉素抗性基因,得到sleB阻断突变株。在L-丙氨酸诱导后,其相对于野生型芽孢萌发延迟。转录分析表明sleB基因在芽孢形成时期开始转录。Western实验表明SleB蛋白在芽孢形成时以前体形式存在,而成熟芽孢中以剪切掉信号肽的成熟形式存在。
第二部分:对天蓝色链霉菌发育分化关键基因-ino1L进行了功能研究。通过PCR克隆得到天蓝色链霉菌sco3899基因,序列比对表明该基因编码一个1-磷酸肌醇合成酶,与结核分枝杆菌的ino1基因有较高同源性,于是将该基因命名为ino1L。通过同源双交换策略构建了该基因的阻断突变株,该阻断突变株表现严重的发育分化缺陷表型。通过肌醇浓度梯度平板观察,在不同的肌醇浓度上,ino1L阻断突变株表现不同的发育分化表型,扫描电子显微镜观察进一步确认了表型观察的结果。通过体内互补和RNA S1核酸酶保护实验,证明ino1L基因在链霉菌发育的各个阶段均有表达,具有两个转录起始为点,可能受不同调控因子调控。当ino1L三阻断突变株和野生型紧邻生长时,野生型菌株能够体外互补突变株表型。