敲低mmu_circ_0001775对小鼠骨髓间充质干细胞成骨能力影响的实验研究

来源 :新疆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qinling88
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目的:探讨敲低circRNA mmu_circ_0001775对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响,分析其在成骨过程中起到的作用。方法:体外获取实验小鼠的骨髓间充质干细胞,并证实其定向分化能力;生物信息学分析工具推测miR-335-5p关联较为紧密的上游环状RNA为mmu_circ_0001775,利用前期试验结果判断慢病毒感染骨髓间充质干细胞的最佳感染浓度,将敲低mmu_circ_0001775的慢病毒和阴性对照病毒转染至骨髓间充质干细胞,激光共聚焦显微镜、流式细胞技术观察并检测慢病毒的转染效率;用细胞增殖与毒性检测法检验BMMSCs转染病毒后的细胞毒性;将转染过的细胞进行成骨诱导,在7天14天时用qRT-PCR检测各组Runt相关转录因子2、骨钙素、mir-335-5p及mmu_circ_0001775的表达水平;茜素红染色观察,验证其成骨作用;Western blot检测Opn、Bmp2的表达。结果:①激光共聚焦影像和流式细胞技术结果表明:慢病毒转染骨髓间充质干细胞的绿色荧光蛋白EGFP表达水平在各组间没有明显差异,差异无统计学意义(P>0.05);细胞增殖与毒性检测试剂结果显示:空白组(未转染病毒细胞)、LV-BMMSCs组(转染空载病毒细胞)、LV-mmu-circ-0001775-BMMSCs组(转染含敲低 mmu-circ-0001775 病毒的细胞)三组相互比较,LV-mmu-circ-0001775-BMMSCs组细胞增值速度加快;②茜素红染色表明:随诱导时间的增长,各组钙结节逐渐变大,但转染慢病毒的LV-mmu-circ-0001775-BMMSCs组显示出有更多的钙结节,颜色也更深;③QRT-PCR结果表明:mRNA基因水平上,LV-mmu-circ-0001775-BMMSCs组各时间点Runx2、Ocn表达高于LV-BMMSCs组、成骨分化诱导组及空白组,差异有统计学意义(P<0.01);④Western blot结果表明:在蛋白水平上,LV-mmu-circ-0001775-BMMSCs组蛋白膜上可结合更多的Bmp2、Opn蛋白,Bmp2、Opn相对表达量均明显高于LV-BMMSCs组及成骨分化诱导组,差异有统计学意义(P<0.05);结论:敲低环状RNA mmu_circ_0001775可传递至骨髓问充质干细胞,同时在一定程度上可以提高骨髓间充质干细胞的增殖及成骨能力。
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