研究目的血管生成拟态(VM)是一种非内皮血管依赖的微循环模式,促进肿瘤的转移以及疾病的进展。本课题组前期实验研究表明人乳腺癌组织中存在血管生成拟态,并往往造成患者不良的预后,但是其机制仍然不十分明确。另一方面,近些年来研究表明乳腺癌肿瘤干细胞(BCSC)与乳腺癌的转移及治疗抵抗相关,并且在远端部位赋予肿瘤细胞形成转移灶的能力。Nodal信号在胚胎的发育阶段扮演重要角色,而近期研究发现其能够在恶性肿瘤组织中重新表达。鉴于Nodal在胚胎及肿瘤中的作用,本实验旨在探讨Nodal信号是否在乳腺癌中促进血管生成拟态形成及在乳腺癌干细胞中的作用,并进一步探究其机制及信号通路。希望能为今后的应用找到新的靶点从而抑制乳腺癌复发转移进而最终提高患者生存率。研究方法1、利用免疫组织化学染色分析100例乳腺癌样本中Nodal表达情况,同时利用Western blot实验检测并比较人乳腺癌肿瘤组织以及配对的癌旁组织中Nodal蛋白表达水平。并进一步利用临床病理资料分析乳腺癌病例中Nodal与肿瘤淋巴结转移、病理学分级、分期及生存率的关系。2、乳腺癌切片进行CD31PAS双重染色判断VM结构,并应用Kaplan-Meier进行生存分析。此外,利用免疫组化染色判定Nodal表达与VE-cadherin、CD44、Slug表达之间的关系。3、通过Western blot分析了乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中Nodal蛋白的本底表达情况。利用慢病毒质粒从基因水平干扰或过表达Nodal,并筛选建立稳定的Nodal敲低或过表达细胞系。Western blot检测4种Nodal sh RNA慢病毒质粒转染效果。嘌呤霉素筛选后Western blot,RT-PCR验证结果。4、为了排除脱靶效应,通过过表达Nodal敲低细胞系(sh Nodal4)中Nodal水平进行挽救实验,Western blot检测表达恢复情况,同时选取231-sh Nodal3及231-sh Nodal4,及Nodal表达恢复组进行后续功能试验5、Western blot和RT-PCR实验检测Nodal与内皮特异性标记物VE-cadherin表达的关系。利用胶上及胶内三维培养观察各组乳腺癌细胞体外形成管道结构的能力,并对三维管道进行免疫荧光Nodal/VE-cadherin双重染色,并应用激光共聚焦显微镜分析。6、利用western blot检测Nodal敲低或过表达的乳腺癌稳转细胞系中p-Smad2/3水平。在MCF-7-Con,MCF-Nodal和MDA-MB-231-sh Con细胞应用SB431542,利用Western blot检测Nodal,p-Smad2/3,VE-cadherin,MMP2及MMP9蛋白的表达水平,并通过免疫荧光验证。明胶酶谱检测MMP2及MMP9蛋白活性。最后三维培养中应用SB431542,观察Smad2/3通路在VM形成中的作用。7、利用划痕实验、迁移实验和侵袭实验分析Nodal信号及Smad2/3通路对乳腺癌迁移及侵袭能力的影响。通过Western blot检测EMT相关标记物Vimentin、N-cadherin及E-cadherin表达水平,以及Nodal对转录因子Slug,Snail和c-Myc表达的影响,进一步利用各组乳腺癌细胞爬片的免疫荧光染色验证并明确各指标在细胞的定位关系及表达。8、利用肿瘤细胞平板克隆形实验来评估乳腺癌细胞自我更新以及增殖能力,通过利用无血清悬浮培养测定乳腺癌细胞形成肿瘤干细胞球能力。同时应用SB431542观察对各组细胞的影响。9、通过Western blot探究Nodal及Smad2/3通路对乳腺癌相关的干细胞标记物ALDH1,CD44及CD133的表达水平,以及对相关转录因子Sox2,Oct4和Nanog表达的影响。并进一步利用各组乳腺癌细胞爬片进行免疫荧光染色验证。10、利用各组稳定转染乳腺癌细胞系皮下注射裸鼠,验证Nodal信号在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中促进肿瘤形成及增殖中的作用,通过测量记录皮下肿瘤的直径,绘制裸鼠移植瘤生长曲线,并腹腔隔天注射SB431542溶液(10mg/kg/小鼠),验证SB431542应用在体内的可行性。11、对各组移植瘤切片进行Endomucin/PAS免疫组织化学双重染色,显微镜下计数VM形成的数量。此外进行Nodal、p-Smad2/3、VE-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP2、Slug及CD44免疫组织化学染色,检测移植瘤中VM及CSC相关蛋白的表达。研究结果1、与配对的邻近正常组织相比,乳腺癌组织中的Nodal蛋白水平显著上调(P<0.05)。免疫组化结果中,Nodal阳性染色定位于乳腺癌细胞的胞质中,在这100例乳腺癌免疫组化染色中,有62例为Nodal染色阳性,Nodal高表达与发生淋巴结转移(P=0.000),分化较差(P=0.003),生存率低呈正相关(P=0.013)。2、结果表明Nodal的表达与乳腺癌中VM的存在呈正相关(P=0.005)。且与内皮特异性标记蛋白VE-cadherin的表达(P=0.000)及Slug染色阳性(P=0.001)高度相关。同时BCSC标记蛋白CD44的表达导致患者生存率降低(P=0.022),与Nodal表达亦存在显著相关性(P=0.000)。3、MDA-MB-231细胞转染的4种sh RNA慢病毒质粒中,sh Nodal4具有最好的干扰效果,其敲低Nodal表达效率超过80%。而MCF-7细胞转染慢病毒Nodal过表达质粒。Western blot及PCR结果验证MDA-MB-231中Nodal蛋白表达及m RNA转录被显著抑制。MCF-7 Nodal稳转细胞系中Nodal蛋白表达及m RNA转录明显增强。光镜下观察,MCF-7-Nodal细胞从上皮表型转变为成纤维细胞样形态,MDA-MB-231-sh Nodal细胞中EMT表型无非常显著的逆转。4、Western blot结果显示sh Nodal4干扰效率约为80%,sh Nodal3为70%,此外,231-sh Nodal4挽救试验组中的Nodal表达水平已恢复。5、结果显示MDA-MB-231细胞中Nodal表达的下调,降低了VE-cadherin转录及翻译水平,并抑制其形成完整的VM样管道结构,作为对比231-sh Control细胞在胶上及胶内三维培养中均形成典型的管道样结构;MCF-7实验组中,Nodal过表达上调VE-cadherin蛋白和m RNA表达水平,并促使本身无形成VM管道能力的MCF-7细胞在胶上及胶内均形成了经典的VM样管道结构。三维管道免疫荧光染色显示Nodal集中在形成VM样管道的细胞中以及这些结构的边缘,同时这些结构管壁高表达VE-cadherin蛋白。6、MDA-MB-231细胞中Nodal的敲低降低Smad2/3磷酸化水平,而MCF-7细胞中Nodal过表达显著增加Smad2/3的磷酸化。SB431542处理后,Western blot结果显示处理组Smad2/3磷酸化水平被显著抑制,VE-cadherin表达下调。Western blot及明胶酶谱实验表明,Nodal能促进MMP2和MMP9的胞内的表达和分泌形式蛋白活性的增加。同时,SB431542在一定程度上抑制MMP2和MMP9的表达和活性,且影响体外三维培养中VM的形成。7、Nodal信号能够促进乳腺癌细胞体外迁移能力以及侵袭能力,而在各实验组中加入SB431542能够限制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。Western及免疫荧光结果表明,Nodal信号可以通过Smad2/3通路上调间质标志物N-cadherin和Vimentin,下调上皮标志物E-cadherin,同时促进转录因子Snail,Slug和c-Myc的表达。8、在MDA-MB-231细胞中Nodal表达的敲低减少了乳腺癌肿瘤细胞克隆的形成,实验还观察到肿瘤干细胞球的形成率及体积显著降低,而Nodal过表达显著增加了MCF-7肿瘤细胞克隆的大小和数量,并增加肿瘤干细胞球的形成能力。应用SB431542后抑制了克隆形成及干细胞球的形成。9、结果显示,Nodal信号促进了CSC相关标记物和因子ALDH1,CD44,CD133,Sox2,Oct4和Nanog的表达水平,当阻断Smad2/3通路时CSC相关标记物的表达被不同程度抑制。10、与231-sh Con组相比,在231-sh Nodal组中肿瘤生长显著减慢(P<0.01),该组肿瘤的体积也显著减少。Nodal的过表达显著促进MCF7-Nodal组中的肿瘤生长(P<0.01)。而SB431542注射组中,肿瘤生长速率被抑制,致瘤性被削弱。11、在乳腺癌裸鼠移植瘤中Nodal信号促进乳腺癌细胞表达VE-cadherin、Vimentin、MMP2、Slug及CD44并降低E-cadherin表达水平。同时能够在体内环境下促进乳腺癌血管生成拟态的形成。并证实了SB431542在裸鼠模型应用的可行性,有效减少了VM的形成。结论1、人乳腺癌组织中Nodal信号的高表达与乳腺癌转移及不良预相关2、体外实验中,Nodal信号上调VM相关蛋白的表达水平,并促进乳腺癌细胞在胶上及胶内VM的形成,此外Nodal及VE-cadherin在VM管道中的表达具有相关性。3、Nodal促进Slug、Snail及C-myc表达,增加乳腺癌细胞的迁移、侵袭及塑形能力,并诱导EMT过程从而导致VM的形成。4、另一方面Nodal调控乳腺癌干细胞表型,促进ALDH1、CD44以及CD133表达,从而增加乳腺癌细胞致瘤性及多分化潜能。5、在乳腺癌细胞中,Smad2/3通路在Nodal信号传导调控VM及干细胞表型中发挥十分关键的作用6、Nodal信号在体内实验中显著促进乳腺癌细胞致瘤性,并促进VM形成。同时,在体内及体外实验中,SB431542能够抑制Smad2/3磷酸化从而阻断Nodal信号转导为乳腺癌治疗提供前期实验基础。