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目的:股骨头坏死是一种临床常见、难治的骨科疾病,近年来发病率呈年轻化趋势。通过“保髋”手术清除病灶修复股骨头,保留自身患者的髋关节,延缓甚至避免行人工髋关节置换,具有极高的临床、社会价值。“保髋”手术清除坏死骨组织后造成的骨缺损区需要通过植入植骨材料进行修复,而目前临床应用的各类骨植入材料均存在不同程度的缺陷。本课题拟采用新兴3D打印增材制造技术结合离子掺杂生物材料改性,并负载可控释载药微球,研发一种新型的骨组织工程支架——3D打印镁/β-磷酸三钙/rhBMP2-PLGA（Mg-TCP/rhBMP2-PLGA）复合支架。从理化特性及体内、外骨修复重建性能、血管再生性能等方面对3D打印镁/β-磷酸三钙/rhBMP2-PLGA复合支架进行综合评价。方法:本课题研究由四部分实验内容组成:（1）3D打印镁离子掺杂β-磷酸三钙多孔支架的制备及其理化性能的研究:选择氧化镁作为镁离子的来源,设置不同比例的掺镁量对β-磷酸三钙进行功能性离子掺杂改性;根据预设的CAD模型,利用低温挤出式3D打印机及高温烧结工艺将改性后的几组镁离子掺杂β-磷酸三钙材料制成多孔支架。通过形貌观察、孔隙率测定、机械性能测定、物相分析、元素构成分析及体外降解离子释放行为分析对支架性能进行综合表征,探讨镁离子掺杂β-磷酸三钙多孔支架在理化方面的性能优势。（2）3D打印镁离子掺杂β-磷酸三钙支架的生物学性能的研究:采用实时浸提的方法,在体外探究支架降解过程中释放出的镁离子对hBMSCs及HUVECs细胞行为的影响,从细胞增殖、活力、形态及hBMSCs成骨分化情况、HUVECs血管生成情况综合分析镁离子掺杂β-磷酸三钙多孔支架对细胞行为学的影响,初步探寻镁离子的最佳掺入比例。（3）3D打印镁/β-磷酸三钙/rhBMP2-PLGA复合支架的制备及其生物学性能的研究:使用复乳乳化挥发法制备rhBMP2-PLGA缓释微球;通过明胶涂覆将载药缓释微球与初步筛选出的三组镁离子掺杂β-磷酸三钙多孔支架复合,合成Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架。利用电子扫描显微镜观察缓释微球及复合支架的形貌特征;ELISA法浓度检测分析载药微球的包封率、载药量及体外药物缓释性能;从细胞增殖、hBMSCs成骨分化情况及HUVECs血管生成情况分析探讨Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架在体外对骨组织修复重建及血管再生的影响。（4）3D打印镁/β-磷酸三钙/rhBMP2-PLGA复合支架的体内骨修复性能的研究:选取8周龄雄性新西兰大白兔作为实验对象,通过手术制备位于股骨远端的股骨外髁标准化骨缺损模型,植入初步筛选出的三组Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架。在每个检测时间点,分别从大体标本观察情况、影像学（Micro-CT）及组织学（病理切片染色）角度进行综合评价,探讨3D打印镁/β-磷酸三钙/rhBMP2-PLGA复合支架在体内对骨缺损区的修复重建效果。结果:（1）制备的镁离子掺杂β-磷酸三钙多孔支架显示出与预设模型相似的多孔表面结构及完全贯通的内部孔道结构。电镜观察到支架上下面正方形微孔边长约为400 μm,侧面矩形微孔边长为300 μm× 100 μm;支架纤维直径约为450 μm。支架纤维表面结晶致密度较高,且各元素在纤维表面分布均匀。制备的四组多孔支架孔隙率位于61.23%-65.02%之间,各组材料组间无明显差异（P>0.05）。镁离子的掺杂明显提高了β-磷酸三钙多孔支架的机械性能,与单纯磷酸三钙支架相比,掺镁组支架的力学性能均得到不同程度的提升,其中1 wt.%氧化镁掺杂组支架表现出了最高的抗压强度和杨氏模量（P<0.05）。物相分析结果表明高温烧结后四组材料的主要晶形为β-TCP,另外生成了少量羟基磷灰石（HA）;单纯磷酸三钙组中一小部分的磷酸三钙发生了 β相向α相的转换,而掺镁的三组材料中则生成了一种新的化合物——磷酸钙镁。各组支架在体外模拟降解的过程中,钙离子的释放较为稳定,磷离子的释放浓度随时间变化呈现上升趋势;掺镁的三组支架释放的镁离子浓度与掺入氧化镁的质量比呈正相关,并随降解时间延长逐渐降低。（2）四组镁离子掺杂β-磷酸三钙多孔支架实时浸提诱导培养的hBMSCs和HUVECs均表现出了不同程度的镁离子浓度依赖性细胞行为。①细胞增殖:随着培养时间的延长,hBMSCs的增殖呈上升趋势;诱导培养早期,四组hBMSCs细胞增殖无明显差异;培养的中后期,1 wt.%氧化镁掺杂组的细胞增殖则明显高于其他组（P<0.01）。单纯磷酸三钙组和1 wt.%氧化镁掺杂组培养的HUVECs在每个时间点均显示出细胞数量的增加,并且1 wt.%氧化镁掺杂组最好（P<0.01）;诱导培养中后期,2 wt.%氧化镁掺杂组培养的HUVECs细胞增殖出现停滞;值得关注的是,4 wt.%氧化镁掺杂组培养的细胞出现了细胞增殖抑制。②细胞活力:两种细胞在四组支架浸提液中均表现出了较好的细胞活力,仅出现了极微量的细胞死亡,说明四组材料没有明显的急性细胞毒性。③细胞形态:hBMSCs和HUVECs在各组支架浸提液中均表现出较好的细胞形态铺展及骨架蛋白产生。④hBMSCs成骨分化检测:ALP活性定性及定量检测结果表明,各组细胞中的ALP活性随着时间的推移呈上升趋势;1 wt.%氧化镁掺杂组的ALP活性明显优于其他组（P<0.05）,该组细胞染出的蓝紫色物质颜色明显亦深于其他三组。茜素红染色结果显示,1 wt.%氧化镁掺杂组细胞在细胞外基质产生了更多的钙结节,染出更多更深的橙红色物质。成骨相关基因RT-qPCR检测发现,1 wt.%氧化镁掺杂组hBMSCs表达的Runx-2、Col-I、ALP、OCN和BSP丰度明显高于其他三组（P<0.05）。⑤HUVECs血管生成检测:NO荧光探针标记证实了镁离子的存在可以增加内皮源性一氧化氮的合成,并且1 wt.%氧化镁掺杂组培养的HUVECs产生了最多的NO。血管化相关基因RT-qPCR检测通用显示1 wt.%氧化镁掺杂组培养的HUVECs在各个时间点表达出更高水平的VEGF及eNOS（P<0.05）。（3）复乳乳化挥发法制备出的rhBMP2-PLGA微球呈乳白色微粒状,SEM观察结果表明:微球粒径分布较为均匀,约为30 μm-100 μ m;微球表面存在一些微小的空洞;Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架互相联通的空隙中灌满了明胶及rhBMP2-PLGA缓释微球。ELISA法浓度检测发现:rhBMP2-PLGA缓释微球的包封率为:87.32±10.83%,载药量为3.49±0.43%;微球在体外降解前24小时出现突释现象,rhBMP2浓度达到6.35±0.21 ng/mL;随后,rhBMP2的释放浓度稳定逐步上升,第28天测得rhBMP2的释放浓度为12.30±0.20 ng/mL。生物学性能:①细胞增殖:随着时间的推移,三组Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架浸提液诱导培养的hBMSCs及HUVECs细胞数量不断上升,1Mg-TCP/rhBMP2-PLGA组的细胞增殖最佳（P<0.01）。②成骨诱导作用:三组Mg-TCP/rhBMP2-PLGA诱导培养的hBMSCs中ALP活性随着培养时间的延长而提高;1Mg-TCP/rhBMP2-PLGA组细胞的ALP活性明显高于其他两组（P<0.05）且染出的蓝紫色物质颜色最深;RT-qPCR结果表明:1Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架具有更好的诱导hBMSCs成骨相关基因表达性能。③血管化诱导作用:NO荧光标记结果表明1Mg-TCP/rhBMP2-PLGA组诱导培养的HUVECs产生的NO最多,而且该组复合支架在各个时间点诱导HUVECs的血管化相关基因表达的丰度优于其他两组（P<0.05）。（4）Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架植入术后实验动物状态良好,仅有2只因术区感染死亡。大体标本结果观察可知,三组Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架可在宿主体内与自体骨组织结合紧密,充分填塞骨缺损区,新生组织长入到支架的孔隙中;空白对照组无明显骨修复迹象,缺损区凹陷。从Micro-CT图像可以看出,植入的Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架紧密嵌入植入区松质骨,支架周围未出现明显的骨吸收征象;术后8周支架出现不同程度的降解吸收;植入组支架孔隙中可以看到不同程度的骨组织修复重建迹象;1Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架植入组新骨再生情况最佳。组织学观察发现,各组支架孔隙中均长入了新生纤维组织与骨组织;支架植入8周后支架孔隙中骨组织的重建较植入4周时明显增多;1Mg-TCP/rhBMP2-PLGA组新生的骨组织相对最多。结论:（1）本课题采用低温挤出式3D打印技术与高温烧结工艺成功制备了一种精准设计、匹配天然松质骨孔隙结构及机械性能要求的新型骨组织工程支架——镁离子掺杂β-磷酸三钙（Mg-TCP）多孔支架。（2）体外细胞实验证实了hBMSCs、HUVECs存在的镁离子浓度依赖性细胞行为;实验结果表明,β-磷酸三钙中掺入0-2 wt%的氧化镁时生物相容性较好;1 wt%的氧化镁掺入可明显诱导hBMSCs成骨分化、HUVECs血管分化。（3）PLGA缓释微球可以保证rhBMP2在局部持续、稳定的释放。rhBMP2-PLGA缓释微球的加载可进一步提高Mg-TCP多孔支架促骨修复重建及血管再生作用,构成“无机支架-有机涂层-细胞因子”三位一体的Mg-TCP/rhBMP2-PLGA复合支架。（4）本课题通过体外、体内成骨及血管再生实验研究确定了掺入1 wt%氧化镁的3D打印镁/β-磷酸三钙/rhBMP2-PLGA（1Mg-TCP/rhBMP2-PLGA）复合支架具有最佳的骨修复重建及血管再生诱导性能。本课题研究为研制出的3D打印镁/β-磷酸三钙/rhBMP2-PLGA复合支架进行产品转化及临床应用提供理论依据及临床前研究基础。