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目的T淋巴细胞介导的免疫应答反应在机体感染和肿瘤免疫中发挥着至关重要的作用。T淋巴细胞活化需要双信号,除了抗原肽-抗原肽受体-MHC复合物提供第一信号外,T淋巴细胞上共信号分子受体和抗原递呈细胞上相应配体结合提供关键的第二信号。第二信号决定了T细胞免疫应答的强度和方向。根据功能,共刺激分子主要分为两类:正性共刺激信号可维持T细胞活化状态,增强T细胞免疫应答反应;负性共抑制信号则可介导T细胞免疫耐受的形成,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。作为新近发现的协同共刺激分子,B7-H3在T淋巴细胞免疫应答中所起的作用还存在着较大争议,本研究拟通过研究B7-H3信号对不同活化状态T淋巴细胞增殖和相关细胞因子分泌的影响,初步探讨B7-H3在T淋巴细胞免疫应答反应中所发挥的作用。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)并从中分选纯T淋巴细胞,体外给予anti-CD3联合anti-CD28单抗共刺激培养,采用流式细胞分析技术(FlowCytoMetry,FCM)观察不同刺激时间点PMBCs中T淋巴细胞及纯T淋巴细胞表面正性功能受体CD28和负性功能受体CTLA-4的变化,分析两组T细胞活化状态。在此基础上,分别在PBMCs中的T淋巴细胞和纯T淋巴细胞未预刺激时及经不同时间预刺激(预刺激第0、1、2、3、4天)时加入人B7-H3-Fc融合蛋白及同型对照Hu-Fc融合蛋白混合共培养,采用CCK8法检测各组T淋巴细胞增殖情况;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测相关细胞因子(IL-2、IL-10及IFN-γ)分泌水平,分析不同活化状态T细胞接受B7-H3信号刺激后是否产生不同免疫应答反应。结果1.FCM检测结果显示外周血单个核细胞(PBMCs)中的T淋巴细胞和纯T细胞在anti-CD3激发型单抗联合anti-CD28激发型单抗刺激下可被有效活化,PBMCs中的T细胞CD3+CD28+双阳性率由共培养第0天时的(28.30±0.034)%上升至共培养第4天时的(80.98±0.018)%(P<0.05),CD3+CTLA-4+双阳性率则未见显著变化(P>0.05);纯T细胞CD3+CD28+双阳性率由共培养第0天时的(58.84±0.021)%上升至共培养第4天时的(85.14±0.041)%(P<0.05),CD3+CTLA-4+双阳性率则未见显著变化(P>0.05)。2.CCK8法测T细胞体外增殖结果显示PBMCs中的T细胞在静息状态(预刺激第0天)时B7-H3分子对其体外增殖有明显抑制作用(P<0.05),当T细胞开始活化(预刺激第1天)时B7-H3分子对其体外增殖仍表现抑制作用(P<0.05),但抑制趋势较前有明显减弱,而当T细胞大部分活化(预刺激第2天)时B7-H3分子对PBMCs中T细胞的体外增殖则无显著影响(P>0.05),而在纯T细胞实验组,无论T细胞处于静息状态、T细胞活化初期还是T细胞大部分活化时(预刺激第0天-第2天),B7-H3分子对其体外增殖均无显著影响(P>0.05)。3.ELISA法检测结果显示在T淋巴细胞未预刺激组,B7-H3信号可以显著抑制IL-2和IL-10的分泌,对IFN-γ分泌则无显著影响,在接受不同预刺激时间的T淋巴细胞组,B7-H3信号可显著促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ,对IL-10分泌则无显著影响。结论1.B7-H3分子可明显抑制PBMCs中的T淋巴细胞体外增殖,而对纯T细胞增殖并无影响,提示B7-H3分子可通过影响免疫微环境中其他免疫成分间接参与T淋巴细胞免疫应答反应;2.随着T细胞活化状态的改变,B7-H3分子发挥的作用也随之改变,提示B7-H3信号对T细胞免疫功能的调节取决于T细胞的预活化状态。