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RNA干扰沉默肺泡巨噬细胞MD-2对脂多糖所致大鼠急性肺损伤的影响背景和目的急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的发病机制复杂,但多种细胞因子和炎症介质以及效应细胞共同参与的、过度失控的炎症反应是发病的关键环节。由于炎症反应的环节众多、过程复杂,难以选择有效的靶点,故缺乏有效的抗炎治疗方法,ALI的病死率仍相当高。致病因子参与的炎症反应的上游环节则简单得多,可能会成为防治过度炎症反应的靶点。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性杆菌的主要致病成分,是导致ALI的重要致病因素。LPS由Toll样受体4(Toll like receptor 4, TLR4)及髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein 2, MD-2)组成的复合受体介导跨膜信号转导,并通过激活效应细胞内的一系列下游信号分子,引起细胞因子和炎症介质的大量释放。MD-2在识别LPS和辅助TLR4将LPS信号转入细胞内的过程中起到核心作用。本研究探讨MD-2在LPS所致大鼠ALI中的作用,以及RNA干扰沉默肺泡巨噬细胞MD-2基因对LPS/TLR4-MD-2/MyD88信号通路及细胞因子分泌的影响。方法1)采用尾静脉注射LPS方法诱导大鼠急性肺损伤模型,20只SD大鼠随机分为对照组和LPS组,测定肺组织湿/干重比值(W/D),肺组织标本石蜡切片常规HE染色观察形态学改变,通过支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞,采用半定量RT-PCR、Western Blot以及免疫组化等方法分别检测肺组织标本和肺泡巨噬细胞MD-2 mRNA及蛋白的表达情况,采用ELISA方法测定血清TNF-α水平。2)体外培养大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383,用以下两种方法进行实验：用不同浓度(0.01μg/ml-10μg/ml)的LPS刺激细胞2h；用单一浓度(1μg/ml)的LPS刺激细胞2h-24h。采用半定量RT-PCR方法检测细胞TLR4 mRNA和MD-2mRNA的表达,采用ELISA方法测定细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。3)设计合成5对针对MD-2的小干扰RNA片段(MD-2 siRNA),运用脂质体Lipofectamine 2000将MD-2 siRNA转染至NR8383细胞,采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法分别检测细胞MD-2 mRNA和蛋白的表达,筛选出最佳MD-2 siRNA序列进行下一步实验。采用以下两种方法对NR8383细胞进行LPS刺激：细胞先经LPS刺激2h,然后转染MD-2 siRNA,称之为LPS+1组；用MD-2 siRNA沉默细胞MD-2基因,然后给予LPS刺激2h,称之为LPS+2组。设置未转染NR8383细胞作为对照组(Blank)。采用实时荧光定量PCR方法分别检测细胞MD-2 mRNA、TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表达,采用Western Blot方法检测细胞MD-2蛋白的表达,采用ELISA方法分别测定细胞培养上清液中TNF-αIL-1β和IL-6的水平。结果1)与对照组比较,LPS组大鼠的肺组织W/D增大,肺泡巨噬细胞和肺组织标本中MD-2 mRNA和蛋白的表达均显著上调(P<0.01),血清TNF-α水平也明显升高(P<0.01)。2)大鼠肺泡巨噬细胞NR8383表达MD-2 mRNA和TLR4mRNA,其中对照组的相对表达量分别为0.52±0.05和0.44±0.09；在0.01μg/mlLPS的刺激下,两者表达无明显变化；在0.1μg/ml时表达量增加；随着LPS浓度的升高表达量进一步增加；在10μg/ml刺激下两者的相对表达量分别为0.72±0.06和0.65±0.10 (P<0.01)。TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度具有类似变化。在1μtg/mlLPS刺激下,TLR4和MD-2 mRNA的表达量在2h明显增加,至6h达高峰(0.67±0.05和0.59±0.05),8h开始回落,但24h仍高于基础值(P<0.01)。TNF-α、IL-6和IL-1p的浓度具有类似变化,其中TNF-α和IL-1p在6h达高峰,持续至8h,IL-6在8h达高峰,持续至12 h。TLR4 mRNA和MD-2 mRNA表达呈正相关(r=0.513,P<0.01)。3)通过检测MD-2 mRNA和蛋白的表达,筛选出最佳MD-2 siRNA序列(正义链：5’-CCA UAU UUA CUG AAU CUG ATT-3’；反义链：5’-UCA GAU UCA GUA AAU AUG GGA-3’),在mRNA水平的最佳干扰时间为24h,基因沉默效率为67%。对照组细胞经LPS刺激后MD-2、TLR4和MyD88 mRNA的表达均显著上调,MD-2蛋白合成显著增加,细胞培养上清液中TNF-αIL-1β和IL-6水平均显著升高(P<0.01)。在LPS+1实验中,干扰组细胞经LPS刺激后MD-2 mRNA的表达量与LPS未刺激组比较未见明显上调(P>0.05)；而TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表达量显著上调(0.69±0.10和0.82±0.09 vs 0.44±0.12和0.62±0.06,P<0.05),细胞培养上清液TNF-α,IL-1p和IL-6水平均显著升高(P<0.01),但mRNA上调幅度和细胞因子水平升高幅度均小于对照组(P<0.05)。在LPS+2实验中,干扰组细胞MD-2 mRNA、TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表达量与LPS未刺激组比较均未见上调,细胞培养上清液TNF-α、IL-1β和IL-6水平亦未见升高(P>0.05)。结论MD-2在LPS所致的大鼠ALI中起重要作用。LPS刺激可引起大鼠肺泡巨噬细胞MD-2和TLR4 mRNA表达上调及细胞因子分泌增加。早期应用或预防应用RNAi沉默MD-2基因可阻断大鼠肺泡巨噬细胞LPS/TLR4-MD-2/MyD88信号通路,减少细胞因子的分泌。