无尾目两栖动物是脊椎动物中物种多样性非常丰富的类群之一,该类群拥有多种多样的生物学特征:如栖息环境、繁殖模式、形态特征等,广泛分布于全球,除开常年被冰雪覆盖的南极洲外,其它大洲均有分布,这些特征使无尾目两栖动物被广泛应用于进化生物学、生态学和保护生物学中的基本问题研究,但是其本身的进化历史和物种多样性的形成过程却并没有得到很好的解决。主要由于可用的分子标记数目比较少,导致系统发育信号不足,使不同研究之间存在很大争议,所以解析无尾目两栖动物的系统发育关系依然存在巨大挑战。Shen等于2013年开发了一套针对有颌类脊椎动物的核基因分子标记工具箱,包含了102个可用分子标记,为无尾目两栖动物的系统发育研究提供了新的分子数据源,但同时也带来了另一个问题:这些分子标记都是通过传统PCR来扩增,如果使用这样多的分子标记就会产生大量的PCR产物,如此大规模的PCR产物如果使用传统的Sanger法测序,会花费很高,能不能探索一种物美价廉的测序方法为新的挑战。为了应对上述两个挑战,本研究从两方面入手,主要研究内容与结果如下。(1)大规模PCR产物高通量测序方法的开发在分子系统研究中,常常需要测定大量的PCR产物序列,以获得相应的分子数据来解析系统发育关系,传统的方法是利用Sanger法测序,但是当PCR产物数目越来越多时,再用Sanger法测序就变得越来越不经济,近十多年来诞生和发展的二代测序,极大的降低了测序成本。部分研究尝试使用二代测序平台中测序读长较长、通量相对较低的平台(如454平台),这些研究要求每个PCR产物要单独定量,然后等量混合,而且要求PCR产物的长度要小于700 bp,这些限制因素不利于这些方法的大范围推广。从某个角度上讲,我们的PCR产物可以近似看作是不同的转录本,在转录组测序中,这些“转录本”不会单独处理,而是混合在一起测序。所以,本研究基于转录组测序的策略,开发了一套大规模PCR产物高通量测序的方法,该方法既避免了单独纯化、定量每一个PCR产物,同时又突破了PCR产物长度的限制,此外使用的是测序成本最低,而且被广泛应用的Illumina HiSeq 2000平台,极大地降低了测序成本。该方法主要过程为,首先将每个样品的PCR产物直接等体积混合,每个样品一个混合样,免去了单独纯化、定量每一个PCR产物的繁琐步骤,极大的提高了实验效率。然后对该混合样进行片段化、平末端与磷酸化和连接法样品特异标签等操作。最后将所有样品的混合样混合在一起作为一个样品送给公司完成测序。对于公司反馈回来的高通量数据,我们首先根据样品特异标签进行分选,然后用转录组拼接软件TRINITY对每个样品的数据进行拼接,之后通过BLAST和后续的优化处理得到PCR产物序列。为了说明该方法的实用性,我们测定了16个物种的101个分子标记的PCR产物。通过2Gb测序读长为90 bp的数据得到了93.5%的PCR产物全长序列,其中最长的PCR产物达到了1650 bp。总而言之,我们开发的这套方法非常适合分子标记数目特别多、样品特别多的系统发育学研究,而且相对于其它方法,我们的方法更快、更经济。(2)无尾目两栖动物的系统发育关系、分歧时间及生物地理分析无尾目两栖动物是两栖动物里物种多样性最多的一类动物(占两栖动物的88%),包含了54个科,446个属,6741个物种,在生物学研究中占有重要地位。关于无尾目两栖动物的系统发育研究一直备受关注,但是由于可用的分子标记数目较少,其系统发育关系存在很大争议。本研究选取了95个核基因分子标记,156个无尾目样品和8个外类群,覆盖了无尾目两栖动物的44个科。通过PCR扩增和上述高通量测序方法获得了最终的分子数据集。该数据集的总长度为88302 bp,完整度为89.6%,是到目前为止,针对无尾目两栖动物系统发育研究使用的最大、最完整的数据集,数据大小至少是前人的7倍。本研究运用最大似然法、贝叶斯法和物种树方法构建了无尾目两栖动物的系统发育树。三种方法得到的拓扑结构非常一致,而且支持率很高。以强烈的支持率解析了一直存在争议的节点(如强烈支持沼蟾科作为新蛙类的基础枝,塞舌尔蛙科为蛙超科的姐妹类群),为无尾目两栖动物的生命之树构建了一个基本框架。随后,结合20个仔细筛选的化石校准进行了无尾目两栖动物的分歧时间估算。结果显示无尾目两栖动物起源于201 Mya的三叠纪晚期,而新蛙类起源于142.1 Mya的白垩纪早期。特别需要指出的是,本研究首次发现三个物种多样性最为丰富的类群(雨蛙超科、姬蛙科和Natatanura)同时在白垩纪-古近纪(K-Pg)时期发生了快速物种多样性分化,分别在很短的时间内(<4.6 Mya)分化形成了多个科,而在K-Pg之前,很长一段时间内(>32 Mya)其祖先并没有分化出新的类群,这说明这些类群的祖先在K-Pg时可能遭遇了灭绝事件的影响,只有部分物种遗留下来并在KPg之后遇上了新的非常适宜生存的生态环境,进而出现了爆发式的辐射进化。生物地理分析显示,新蛙类起源于非洲板块,而无尾目两栖动物之所以出现现在这种全球性分布与泛大陆分裂和之后冈瓦纳大陆的分裂有很大关系。