L-亮氨酸与L-异亮氨酸、L-缬氨酸,合称为支链氨基酸,是哺乳动物体内无法合成的八种必需氨基酸之一。其广泛应用于调味品、饲料添加剂、化妆品和药品等领域。微生物发酵法是工业化生产L-亮氨酸的主要方法。菌种的选育和发酵过程控制是发酵生产L-亮氨酸的核心环节。随着对L-亮氨酸合成途径和相关反馈机制的深入了解,理性代谢工程技术已广泛应用于开发高性能的L-亮氨酸生产菌。然而目前开发的L-亮氨酸生产菌,应用到工业化生产的案例鲜有报道,多数停留在实验阶段。实际上,从微生物育种到生产实践应用,存在大量亟待解决的问题。为此,本研究以一株工业化生产L-亮氨酸菌株Corynebacterium glutamicum CP为研究对象,对其进行理性代谢工程改造,并研究了多种发酵工艺对其生产L-亮氨酸的影响,最后对发酵工艺放大,L-亮氨酸的分离纯化进行了研究。主要研究内容和结果如下:（1）对生产菌进行代谢工程改造,提升了工程菌的底物利用率,降低了副产物的生产。丙酮酸和乙酰辅酶A是合成L-亮氨酸的主要前体物。在工程菌引入来源B.adolescentis的突变体磷酸转酮酶,优化了其转录表达强度,提高了单位葡萄糖生产乙酰辅酶A的能力,然后对竞争代谢途径的基因进行了转录弱化和敲除,提高了L-亮氨酸的产量,减少了副产物L-丙氨酸的生成。最终获得的菌株C.glutamicum CP04(Δltb R::Ptuf-fxpkΔPglt A::Pdap A),摇瓶发酵L-亮氨酸产量为25.2 g/L。（2）研究了多种发酵工艺对工程菌C.glutamicum CP04生产L-亮氨酸的影响。在补料分批发酵中,接种量为20%时,培养基生物素浓度为50μg/L,L-亮氨酸产量为53.0 g/L,副产物L-丙氨酸浓度为6.4 g/L。采用超声辅助发酵工艺生产L-亮氨酸,经优化得到最适的超声参数组合为超声功率密度为94 W/L,超声频率为25 k Hz,超声间隔为31 min,超声持续时间为37 s。L-亮氨酸产量为64.1 g/L,较补料分批发酵提高了20.9%。超声辅助发酵下,细胞形态无明显变化,细胞膜通透性和酶活性显著提高。为解决补料分批发酵存在的问题,采用过程强化工艺,培养C.glutamicum CP04生产L-亮氨酸。采用细胞循环重复分批发酵工艺,L-亮氨酸的平均产量为26.5 g/L,而副产物L-丙氨酸的平均产量为0.87 g/L。与补料分批发酵相比,糖酸转化率和产率分别提高16.2%、48.3%。采用细胞循环连续发酵工艺,稳态时L-亮氨酸的浓度为21.3g/L,副产物L-丙氨酸浓度为0.5 g/L。与补料分批发酵相比,糖酸转化率和产率分别提高18.3%、60.8%。采用恒化培养工艺,稀释率为0.04 h-1,流加培养基添加1.2 g/L乙酸铵,稳态时L-亮氨酸浓度为24.8 g/L,L-丙氨酸浓度为0.8 g/L,糖酸转化率和产率分别提高10.2%、35.0%。综合考虑,选择细胞循环重复分批发酵进行工艺放大研究。（3）在优化小试发酵工艺条件下,在5 m~3罐水平进行中试发酵放大工艺研究。与小试发酵相比,中试发酵L-亮氨酸产量下降,副产物L-丙氨酸积累较多。将直叶搅拌桨更换为斜叶搅拌桨,提高了混合效率,泡沫一定程度减少,菌体浓度、L-亮氨酸的产量、糖酸转化率较改进前分别提高了14.5%、12.0%、8.2%,而副产物L-丙氨酸产量下降12.5%。在5 m~3罐进行细胞循环重复分批发酵研究表明,L-亮氨酸的平均产量为24.4 g/L,L-丙氨酸产量平均为0.9 g/L,与补料分批发酵工艺相比,产率与转化率分别提高了45.4%、5.6%。（4）比较了离子交换层析和电渗析分离纯化工艺的差异。超滤处理细胞循环发酵液时,平均膜通量为24.5 L/m~2/h,滤液的脱色率为58.6%,回收率为87.4%。优化离子交换层析工艺,L-亮氨酸回收率为91.2%。优化电渗析纯化工艺,L-亮氨酸浓度、回收率及纯度分别为16.2 g/L、95.6%、96.3%。确定了活性炭脱色的最短处理时间为20 min,最适处理温度为55℃。离子交换层析纯化工艺所需活性炭为0.5 g/L,而电渗析纯化工艺只需0.3 g/L。浓缩结晶后,离子交换层析工艺纯化L-亮氨酸的回收率和纯度分别为76.8%、95.6%,而电渗析工艺纯化的L-亮氨酸回收率和纯度分别为87.6%、98.7%。