寻找活性成分是中药物质基础研究的核心内容,但由于中草药化学成分复杂,该过程充满了挑战。虽然不少新的研究方法被提出,但结合云南省中草药资源丰富、但经济、技术水平较落后的实际情况,急需寻找一种可行、经济且高效的中草药活性成分筛选方法。本文基于“通过对口服有效的中草药中消化稳定并可吸收入血的原型成分进行筛选,可以较高效地得到中草药活性成分”的命题,提出一种基于消化吸收的中草药活性成分筛选方法。要证明上述方法是否可行、且经济高效,需证明以下假设:1、有些中草药口服有效;2、有效的中草药应该含有活性成分;3、活性成分中有一部分是原型成分;4、中草药中原型成分有一部分消化稳定,并可被吸收入血;5、这些消化稳定可吸收入血的原型成分能被检测、分离得到,并被证实大部分有活性。其中,1-3点根据临床实践和一般逻辑判断可以认为是成立的,所以本文将重点证明第4和第5点。本文将通过文献研究法和案例证明该两点。1、文献研究法:①消化稳定性研究:本文综述了人工胃肠液模型在药学研究中的应用现状,认为该模型是消化稳定性研究的主要手段之一,可用于指导前药、剂型的设计和代谢产物的检测;影响消化稳定的因素主要包括胃肠液pH、消化时间、消化酶等,但现行研究方法不能完全体现影响稳定性的因素是什么,所以我们提出应用析因设计的方法试验,并可以应用于中草药的消化稳定化合物的筛选中;②吸收入血成分研究:“血清药物化学”是近几年出现的一种寻找活性成分的方法,其核心思想是:入血成分可能是中药有效成分。该方法是否高效可行?作者综述了2003-2013年的相关文献并进行统计,结果显示:1、直接报道分析或鉴定中药血中移行成分的文献有100篇,涉及88个复方或者单味药;2、检测到的血中移行成分共970个,其中原型成分为582个,代谢产物388个,60%的入血成分是原型成分,即证明了第4点假设:中草药中有一部分成分消化稳定,并可被吸收入血;3、80.37%的入血原型成分有活性报道(见图1),即证明了第5点假设:吸收入血的原型成分大部分是有活性的。图1血中移行成分统计(A)及鉴定原型的平均活性比例(B)Fig1 The statistical chart of effective constitutes of plasma(A)and the mean activity ratio of identifiedprototype components(B)2、案例研究法:青阳参(Cynanchum otophyllum)是鹅绒藤属植物中的一种常用的抗癫痫的民族药,然而其单体化合物的活性却鲜有报道。本论文将运用消化稳定和血清药物化学的评价方法,筛选青阳参的抗癫痫活性成分,阐明其药效物质基础,并从实例的角度证明“基于消化吸收的中草药活性成分筛选”的可行性。案例研究内容包括:1、在指纹图谱的指导下,进行体内外模拟青阳参消化代谢实验,寻找消化稳定的成分;2、青阳参的血清药物化学研究,寻找入血成分;3、依据消化稳定及入血情况,确定目标化合物并从药材提取物中进行定向分离,得到消化稳定、可以入血的单体化合物,并鉴定结构;4、采用最大电休克(MES)和斑马鱼模型,对目标化合物的活性进行研究,并从5-HT角度探讨它们的抗癫痫作用机理;5、最后,对“基于消化吸收的中药有效成分识别”方法的可行性及推广意义进行初步评价。主要结果如下:1、体内外模拟消化代谢实验结果:按体内外消化后是否稳定存在,青阳参的物质可以分为三类(指纹图谱上的三个区域):①消化不稳定成分:原药材中有,但不存在于体内消化后的样品中;②代谢产物:原药材中没有,存在于大肠消化样品中,被排出体外的成分;③消化稳定成分:均存在于原药材和体内外消化样品中,为最终的目标化合物所在区域。2、青阳参的入血情况分析:经血清药物化学研究,在血浆中只检测到两个较明显的化合物(M1、M2),且M1、M2在原药材中存在,为消化稳定区域③的成分,为消化稳定可吸收化合物。3、目标化合物的定点分离:根据上述实验结果,在HPLC指纹图谱指导下,使用硅胶柱色谱、ODS、MCI、半制备液相色谱等技术从药材提取物中重点分离消化稳定区域③中的化合物,得到五个单体成分:M1、M2、D1、D2、D3,结构鉴定结果显示:5个化合物均为青阳参苷元的C21甾体化合物,糖链的3-O-位单糖链均为3～4个脱氧糖。4、药效试验:MES的试验结果表明,化合物M1、M2、D1、D2、D3单用时没有抗癫痫活性,但与苯巴比妥钠合用时,在剂量10mg/kg、15mg/kg下均有良好的抗癫痫协同作用;同时,M1、M2各以5mg/kg合用时,效果比各自单用(10mg/kg)时更好,暗示着M1+M2是青阳参的有效成分组;斑马鱼的实验结果也表明,化合物M1、M2能降低斑马鱼的快速运动距离,显示一定的抗癫痫活性。5-HT的抗癫痫作用机理结果表明:青阳参单体给药后,小鼠的脑内5-HT含量有升高。提示青阳参单体的抗癫痫作用可能与脑内5-HT的含量有关。以上实验结果表明,筛选得到的5个(M1、M2、D1、D2、D3)化合物,尤其是入血成分M1、M2均有良好的抗癫痫活性,更重要的是找到了 M1+M2的青阳参有效成分组,为阐明青阳参的药效物质奠定了依据,也证实了本文所提出的基于消化吸收的中草药活性成分筛选方法可行、高效、经济。