论文部分内容阅读
目的:本研究采用circRNA Array芯片技术分析法洛四联症和非心脏畸形流产引产胎儿心肌组织中差异表达的circRNA,并定位法洛四联症相关的基因和circRNA,构建法洛四联症相关的ceRNA调控网络。方法:(1)样本搜集和病理解剖学观察本研究选取13例法洛四联症(实验组)和13例非心脏畸形难免流产(对照组)的引产胎儿,转移至病理解剖室进行解剖学观察,并留取右室流出道心肌组织。切取适量心肌进行HE染色切片,观察心肌病理学结构变化。(2)circRNA芯片表达谱分析对所有实验组和对照组26例心肌样本进行RNA的抽提,采用Nano Drop-1000和琼脂糖凝胶电泳对每个待测样本进行质控检测。选取3例实验组和3例对照组,标记cRNA后与Arraystar Human circRNA进行阵列杂交,扫描分析(8×15K),用R软件包对芯片原始数据进行标准化和处理,筛选差异表达的circRNA。(3)构建ceRNA调控网络使用miRNA预测软件分析circRNA/miRNA结合位点,为保证预测结果的有效性,筛选GSE35490数据集(来自GEO数据库)中差异表达的miRNAs,获得与TOF相关的miRNA。将上述两者结果取交集后所得的miRNA输入Target Scan、mi RDB和mi RTar Base数据库进行靶基因预测并进行结果的交集处理获取靶mRNA,除去未匹配miRNA及其对应的circRNA,从而构建出ceRNA网络。(4)GO和Pathway富集功能分析运用Enrichr数据库对ceRNA网络中的关键基因进行富集功能分析;利用CTD数据库阐释ceRNA网络中所含的关键基因和先天性心脏病的关联。(5)RT-q PCR验证及ceRNA关联性分析采用RT-q PCR法扩大样本量(10例实验组和10例对照组)检测心肌组织中待测circRNA和基因的表达水平,验证芯片检测的差异表达结果。通过查询circ Base数据库注释circRNA。结合ceRNA理论,对hsa_circ_0007798与HIF1A相对表达量进行相关性分进行相关性分析。结果:(1)本研究通过局部解剖、组织切片HE染色验证超声诊断胎儿的心血管发育情况和心肌组织结构特征。芯片分析发现与对照组相比,实验组共有214个circRNA上调表达,62个circRNA下调表达。(2)借助miRNA预测软件共获取了768个circRNA的miRNA元件。结合GEO/GSE35490的结果,筛选出98个与法洛四联症相关的miRNA。取上述两者结果的交集,得到25个miRNA,经miRNA靶基因预测及删失处理,最终获得19个circRNA、8个miRNA和34个mRNA,以此构建ceRNA网络。(3)对ceRNA网络的34个关键基因进行GO和Pathway分析,发现最具统计学意义的基因功能是参与心脏发育(P=0.002538)。此外,对法洛四联症的可能致病基因进行鉴定,结果显示上述34个基因均参与或促进“先天性心脏病”的形成,而HIF1A是与先心病最相关的基因。(4)扩大样本量采用RT-q PCR法检测实验组和对照组引产胎儿心肌组织中hsa_circ_0007798的表达水平,结果发现TOF组hsa_circ_0007798的表达明显上调。CircRNA注释:hsa_circ_0007798位于第6号染色体上,由6个外显子组成,全长805bp。hsa_circ_0007798与HIF1A的相关性分析表明两者呈显著正相关(Pearson系数/r=0.6291),最终预测与法洛四联症相关性最大的调控通路为hsa_circ_0007798/mi R-199b-5p/HIF1A。结论:(1)临床上心脏彩超初步诊断为TOF的胎儿,经局部解剖及组织切片HE染色可验证心脏彩超的诊断。(2)共有19个circRNA、8个miRNA和34个mRNA可能参与TOF形成;34个相关基因的最主要功能是参与心脏发育,而且HIF1A是最显著的标记基因。(3)与对照组相比,TOF组hsa_circ_0007798的表达明显上调。而且hsa_circ_0007798与HIF1A存在明显的相关性。本研究成功构建了法洛四联症相关的调控通路:hsa_circ_0007798/mi R-199b-5p/HIF1A。