自噬(Autophagy)作为细胞内代谢废物清除及循环利用机制而参与肝细胞内脂质代谢,且据文献报道自噬过程广泛参与骨骼肌、胰腺、肝脏等代谢活跃器官细胞代谢,在肥胖及胰岛素抵抗过程中发挥重要作用。但自噬在另一机体能量代谢核心器官---脂肪组织---中的研究却甚少,特别是自噬在运动改善机体脂肪组织脂质代谢方面的作用鲜有报道,而且在有限的研究报道中,还存在大量争议性结果,如肥胖状态下脂肪组织自噬活性到底如何变化?脂肪组织自噬活性变化有无部位特异性?运动对脂肪组织基础自噬活性有何影响?运动对肥胖状态下脂肪组织自噬活性的影响如何?自噬是否通过改善肥胖症脂肪组织炎症状态参与运动后减脂过程?同时长时间有氧耐力运动作为传统减肥运动处方的必备内容,已成为学者研究自噬介导运动抗脂减肥分子机制的主要运动形式,而且近年来抗阻运动的减肥效果也逐渐得到认可,但其对脂肪组织自噬的影响却未见报道。因此,本研究的目的在于探讨肥胖状态下脂肪组织自噬活性与炎症状态的变化,观察自噬活性变化有无脂肪库特异性,在此基础上,对肥胖小鼠进行耐力与抗阻运动干预,观察不同类型运动干预减脂效果的同时,检测运动对肥胖症内脏脂肪组织自噬活性的影响,并初步探讨运动后脂肪组织自噬与炎症的相关关系,推测不同类型运动方式减脂的潜在分子机制,为进一步认识运动抗肥胖和运动防治脂肪异常积累及相关代谢疾病提供新的理论支撑与实践策略。1建立肥胖动物模型目的:建立肥胖小鼠动物模型。方法:四周龄清洁型雄性C57BL/6小鼠共170只,随机分为普通膳食组(NFD:n=16)和高脂膳食组(HFD:n=154),并分别喂以普通标准饲料和高脂饲料,每周称重。经八周不同膳食干预后,按照肥胖易感理论选取HFD组体重增量较大的1/3,且体重超过NFD组均值20%的小鼠作为肥胖小鼠模型(50只)。然后随机从NFD组和预选的HFD组挑选各8只,分别为NC组和HC组处死取材,分别测量体重、体长、体脂及检测血脂四项进行肥胖成模评价。结果:干预前各组小鼠体重无显著性差异(p>0.05),8周膳食干预后,两组小鼠体重均显著增加(p<0.05),且HC组体重、Lee’s指数、内脏脂肪绝对质量和体脂指数均显著高于nc组(p<0.05);与nc组相比,hc组血清tg升高,但差异不显著(p=0.13),而tc和ldl-tc均显著升高(p<0.05),同时hdl-tc显著降低(p<0.05);he染色发现nc组小鼠内脏脂肪细胞直径短,体积小,数量多,而hc组小鼠内脏脂肪细胞则体现为直径长、体积大,数量少。小结:通过8周高脂膳食可成功诱导c57bl/6小鼠成为肥胖动物模型。2肥胖症皮下和内脏脂肪组织自噬活性特异性变化目的:检测肥胖状态下皮下和内脏脂肪组织自噬活性的变化及其部位差异,初步探讨肥胖状态下自噬活性和炎症状态的相关关系。方法:随机从nfd组和成模hfd组挑选各8只小鼠,分别为lean组和obesity组,经麻醉灌流后迅速取腹股沟皮下脂肪组织(sc)和附睾脂肪垫脂肪组织(vis),并用rt-pcr和wb分别检测自噬标志基因和蛋白表达,同时检测相关炎症因子的基因和蛋白表达。结果:(1)自噬活性。基因表达双因素方差分析及事后检验显示p62mrna表达与lean-sc组相比,obesity-sc组脂肪组织p62mrna相对表达量显著升高(p<0.05);蛋白表达的双因素方差及事后检验分析显示与lean-visc组相比,obesity-visc组becn1蛋白表达、lc3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高(p<0.05),与lean-sc组相比,obesity-sc组p62蛋白表达显著降低(p<0.05)。(2)炎症反应。基因表达的双因素方差分析及事后检验显示与lean-sc组相比,obesity-sc组和lean-visc组脂肪组织il-6mrna相对表达量显著升高(p<0.05),而lean-sc组与obesity-sc组、lean-visc组与obesity-visc组分别比较后发现,il-10mrna相对表达量均显著降低(p<0.05);蛋白表达的双因素方差分析及事后检验显示与lean-sc组相比,obesity-sc组和lean-visc组脂肪组织il-6、il-1β蛋白表达均显著升高(p<0.05),与lean-visc相比obesity-visc组脂肪组织il-6、il-1β蛋白表达显著升高(p<0.05),il-10蛋白表达显著降低(p<0.05),与obesity-sc组相比,obesity-visc组脂肪组织il-6蛋白表达显著升高(p<0.05),il-1β蛋白表达则显著降低(p<0.05)。(3)自噬与炎症的相关关系。becn1蛋白表达与炎症因子il-6蛋白表达呈正相关(r=0.29,p=0.05);p62基因与蛋白的表达与炎症因子il-6分别呈现正相关(r=0.30,p>0.05)和(r=0.51,p<0.05),与il-10表现出低度正相关性(r=0.28,p>0.05)和(r=0.25,p<0.05);lc3蛋白表达与il-10蛋白表达呈现中度正相关(r=0.52,p<0.05);il-1β与自噬相关蛋白的相关分析中均未显示出明显的相关关系。小结:肥胖状态下脂肪组织自噬活性升高,且没有部位差异;肥胖状态下脂肪组织炎症反应都升高,且内脏脂肪组织炎症反应更高;自噬与炎症在肥胖发生过程中具有同升的变化趋势,肥胖状态下脂肪组织自噬激活可能是限制过度炎症反应的代偿机制。3不同运动对肥胖症内脏脂肪组织自噬和炎症状态的影响目的:观察肥胖小鼠经不同类型运动干预后减脂效果,同时检测不同运动对肥胖症内脏脂肪组织自噬活性和炎症反应的影响,并探讨运动后脂肪组织自噬与炎症的相关关系,揭示运动减脂的潜在分子机制。方法:取nfd组小鼠8只作为普通膳食对照组(nnc组),取肥胖成模小鼠42只随机分为高脂膳食对照组(hhc组,n=9)、普通膳食干预组(hnc组,n=9)、普通膳食联合耐力运动干预组(hnc组,n=12)、普通膳食联合抗阻运动干预组(hnr组,n=12),其中,hne和hnr组小鼠分别进行为期8周的跑台耐力和爬梯运动,其余各组小鼠饲以相应鼠粮作为安静对照组。然后通过rt-pcr及wb检测内脏脂肪组织自噬、炎症、内质网应激及抗氧化等标志基因与蛋白的表达量,同时tem及ihc的方法观察内脏脂肪组织自噬体及相关蛋白表达情况。结果:(1)肥胖表征。与hhc组相比,hnc组小鼠及运动组小鼠体重、lee’s指数、内脏脂肪质量及体脂指数均发生显著性下降(p<0.05),且运动组小鼠体重、内脏脂肪质量及体脂指数下降幅度均大于hnc组,但干预后两个运动组间的体重、内脏脂肪质量及体脂指数并无差异(p>0.05)。(2)自噬活性。与hhc组相比,hnc组atg5mrna表达显著下降(p<0.05),lc3Ⅱ/Ⅰ比值显著下降(p<0.05),hne组ulk1、becn1、atg5mrna表达显著下降(p<0.05),atg7、p62mrna表达显著升高(p<0.05),becn1蛋白表达及lc3Ⅱ/Ⅰ比值显著下降(p<0.05),p62蛋白表达显著升高(p<0.05),hnr组atg5mrna表达显著下降(p<0.05),atg7、p62mrna显著升高(p<0.05),becn1蛋白表达及lc3Ⅱ/Ⅰ比值显著下降(p<0.05);与hnc组相比,hne组atg7、p62mrna表达量显著升高(p<0.05),p62蛋白表达显著升高(p<0.05),hnr组atg7mrna表达量显著升高(p<0.05);与hne组相比,hnr组becn1mrna表达量显著升高(p<0.05),p62蛋白表达显著降低(p<0.05)。(3)炎症反应。与hhc组相比,hnc组il-1β蛋白表达显著下降(p<0.05),hne组il-10mrna显著升高(p<0.05),il-6、il-10蛋白表达显著升高(p<0.05),il-1β蛋白表达显著下降(p<0.05),hnr组mcp-1、il-6、il-10mrna表达显著升高(p<0.05),il-6、il-10蛋白表达显著升高(p<0.05),il-1β蛋白表达显著下降(p<0.05);与hnc组相比,hne组il-10mrna表达显著升高(p<0.05),il-6、il-10蛋白表达显著升高(p<0.05),il-1β蛋白表达显著降低(p<0.05),hnr组il-6、il-10mrna表达显著升高(p<0.05),il-10蛋白表达显著升高(p<0.05),il-1β蛋白表达显著降低(p<0.05);与hne组相比,hnr组il-6mrna表达显著升高(p<0.05),il-10mrna表达显著降低(p<0.05)。(4)自噬调节蛋白。与hhc组相比,hne组mtorc1mrna及蛋白表达显著升高(p<0.05),hnr组mtorc1mrna表达显著升高(p<0.05);与hnc组相比,hne组mtorc1mrna及蛋白表达显著升高(p<0.05),hnr组mtorc1mrna表达显著升高(p<0.05);与hne组相比,hnr组mtorc1mrna表达显著升高(p<0.05),而mtorc1蛋白表达显著下降(p<0.05)。(5)自噬与炎症的相关关系。p62在基因水平与il-10及il-1β表现出中度相关关系(r=0.57和-0.69),且均具有显著性(p<0.05),而p62蛋白表达同时与il-6和il-10表现出具有显著性的中度相关关系(p<0.05),相关系数分别达到0.51和0.64。lc3蛋白表达与il-10蛋白表达展现出较好的相关性(r=0.55,p<0.05),ulk1、atg5、atg7基因均与il-10存在良好的相关关系(-0.43、-0.67、-0.62)。(6)内质网应激。与hhc组相比,hne组和hnr组grp78、chop蛋白表达均显著降低(p<0.05),与hnc组相比,hne组和hnr组grp78蛋白表达显著降低(p<0.05),hnr组chop蛋白表达显著降低(p<0.05)。(7)抗氧化状态。与hhc组相比,hnc组和hne组sod1蛋白表达显著增加(p<0.05),与hnc组相比,hne组和hnr组sod1蛋白表达显著下降(p<0.05)。小结:(1)正常膳食结合运动干预可显著减少内脏脂肪质量,两种运动方式减肥效果无差异。(2)运动后内脏脂肪组织自噬活性受到抑制,且有氧运动抑制作用更强,此外,mtorc1介导有氧运动对自噬抑制作用,而抗阻运动的自噬抑制作用可能不依赖mtorc1。(3)正常膳食结合有氧运动或结合抗阻运动在改善内脏脂肪组织肥胖性慢性炎症状态方面具有相似效果,且在转录水平上抗阻运动的干预效果可能弱于有氧运动。(4)正常膳食结合运动干预后自噬与炎症反应总体上呈现同降的变化趋势,且促炎因子il-10在反映炎症与自噬的变化关系中最为敏感,而其作用机制可能包括内质网应激状态变化、抗氧化状态变化等。全文结论(1)肥胖状态下脂肪组织自噬激活且没有部位差异,但炎症反应的升高存在部位差异,即内脏脂肪组织炎症反应强于皮下脂肪组织。(2)8周正常膳食结合不同类型运动干预减肥效果无差异,且干预后内脏脂肪组织自噬活性受到抑制,但相对抗阻运动而言,有氧运动自噬抑制作用更强,同时mTORC1介导了有氧运动造成的肥胖小鼠内脏脂肪组织自噬抑制作用,而抗阻运动则可能不依赖mTORC1的激活。(3)肥胖症运动干预前后内脏脂肪组织自噬与炎症具有同升共降的变化趋势。且抗炎因子IL-10在反映炎症与自噬的变化关系中最为敏感,而其作用机制可能包括(1)脂肪细胞体积变化;(2)内质网应激状态变化;(3)脂肪细胞抗氧化状态变化。