一、研究背景证是机体在疾病发展过程中的某一阶段的病理概括，由于中医证候是通过望、闻、问、切四诊所获得的一组具有相互关联的症状和体征群的信息整理而得，缺乏客观指征，临床把握中很大程度的依赖于医生的诊疗水平。为此，许多学者期望依赖现代科学技术手段发现并阐明证候实质。近20年来有关证的生物学基础研究有很多，由于基因的表达、调控及其相关产物生物学效应的许多特点与中医整体生理病理观存在许多切合点，因此，中医证和基因关系研究受到重视，有可能从新的角度揭示辨证的基础和证的实质。肾为先天之本，是构成胚胎发育的原始物质，其与现代医学描述的遗传物质（DNA）具有一定的同一性；肝脏的功能由肝细胞完成，而肝细胞则由功能基因表达从而行使功能。流行病学调查显示，肝肾阴虚证是慢性乙型肝炎肝癌患者中常见证候之一。同时临床实践表明，肝癌患者伴发西医其他疾病的发生率相对较低（早、中期肝癌患者其他疾病合并率小于32%）。因此，选择肝癌患者作为研究对象能够“淡化”疾病“背景”因素对“证”的研究结果的干扰。并且由于证是机体在致病因素作用下的全身性抗病调控反应的综合临床表现，包含了致病因素和机体反应能力两方面决定条件。外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cell，PBMC）主要包括淋巴细胞和单核细胞，它能够随外周血循环全身可以很好地反应全身的机能应答，因此从人体PBMC中探索有望找出证候的物质基础。再加上血标本容易被患者接受，采集简单，为临床应用及结果验证都提供了方便。本研究以PBMC为检测标本，采用基因芯片技术检测肝癌肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证差异基因表达，并对差异基因mRNA及蛋白改变的方向和程度及这些改变与肝癌肝肾阴虚证之间关系进行分析，找到肝癌肝肾阴虚证的显著性差异基因及蛋白，丰富对证的系统生物学认识。二、研究目的1、通过检测肝癌肝肾阴虚证和非肝肾阴虚证基因表达情况，明确两者之间存在差异表达。2、明确肝癌肝肾阴虚证差异基因参与的主要功能与通路，选取共有差异基因构建两种不同状态下的基因共表达网络。3、分析肝癌肝肾阴虚证基因共表达网络，结合芯片验证结果，筛选显著性差异基因。4、扩大样本量，对筛选出的显著性差异基因进行mRNA与蛋白水平检测，利用验证结果构建肝癌肝肾阴虚证诊断模型。三、研究方法1、选取肝癌肝肾阴虚证和非肝肾阴虚证作为研究对象，采用全基因组表达谱芯片，研究两组之间差异基因表达。利用经随机方差模型修正后的t检验（random variancemodel t-test，RVM t-test）计算芯片探针的显著性水平（P-value）和误判率（false positiverate，FDR），筛选出两组间差异表达的探针及基因。2、结合SAS软件对差异基因进行分析，基于Gene-Ontology（http://www.gene-ontology.org/）、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）数据库对差异基因进行功能（geneontology，GO）和通路（pathway）注释，选取差异基因构建两种不同状态下的共表达网络图。3、扩大样本量，运用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-PCR）对共表达网络中具有重要表达能力的差异基因进行芯片结果验证，依据差异基因的mRNA表达绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线，计算曲线下面积（area under curve，AUC）结合差异基因相关系数标准化法筛选肝癌肝肾阴虚证显著性差异基因。4、运用RT-PCR与蛋白免疫印迹法（western blotting）分别从mRNA及蛋白层面对显著性差异基因进行检测，利用检测结果构建肝癌肝肾阴虚证诊断模型，并计算其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。四、实验结果1、比较肝癌肝肾阴虚证和非肝肾阴虚证基因的表达水平，筛选出两组间差异表达探针876条，其中上调的387条，下调的489条，涉及差异表达基因615个。2、肝癌肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证比较，上调基因功能138项，主要包括跨膜转运、细胞周期停滞、细胞转录、诱导凋亡等。下调基因功能140项，主要包括协调转录、抗凋亡、调节细胞周期、免疫应答等；肝癌肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证比较，上调差异基因主要参与抗原加工与递呈、代谢途径等16条信号通路。下调差异基因参与细胞周期、能量代谢、蛋白质输出等10条信号通路。取GO analysis与pathway analysis内所含交集基因，基于肝肾阴虚证组与非肝肾阴虚证组基因间的表达相关性，构建两个不同状态下差异基因的共表达网络图。3、选取60例肝癌患者，对共表达网络中筛选出的18个具有重要表达能力的差异基因进行芯片结果验证。结果显示肝肾阴虚证组在11个下调差异基因的mRNA表达低于非肝肾阴虚证组；同时，肝肾阴虚证组在8个上调差异基因的mRNA表达高于非肝肾阴虚证组。依据18个差异基因的mRNA表达，绘制ROC曲线结合差异基因相关系数标准化法筛选出|⊿degree Normalized|>0.3、ROC曲线下面积>0.8的三个肝癌肝肾阴虚证组显著性差异基因（SEC62[SEC62homolog (S.cerevisiae)]、CCNB1[cyclin B1]、BIRC3[baculoviralIAP repeat-containing3]）。4、选取肝癌肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证患者总计120例，分别从mRNA及蛋白层面对显著性差异基因进行检测。结果显示：肝肾阴虚证组在基因SEC62、CCNB1、BIRC3中的mRNA表达低于非肝肾阴虚证组（P<0.001、P<0.001、P=0.001）；在这三个基因的蛋白表达水平，肝肾阴虚证组同样低于非肝肾阴虚证组（P<0.01）。基于患者在基因SEC62、CCNB1、BIRC3的mRNA表达绘制ROC曲线，曲线下面积分别为（0.716、0.682、0.639），运用Sec62、Cyclin B1、Birc3mRNA表达联合用于诊断肝癌肝肾阴虚证，其灵敏度为85%、特异度为78.3%、阳性预测者为79.7%、阴性预测值为83.9%。五、实验结论：1、从基因组学的角度反映出肝癌肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证之间存在着差异表达。2、通过分析肝癌肝肾阴虚证差异基因GO与pathway的注释结果，发现与以往通过“以药测证”、“异病同证”、“动物模型”等方法研究肝肾阴虚证差异基因的GO、pathway分析结果存在部分一致，均检测出与代谢、凋亡相关的GO或pathway改变；通过构建基因共表达网络，发现肝癌肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证之间存在着基因立体关系网。进一步证实从人体外周血单个核细胞中探索有望找出证候的物质基础，表明证候的物质基础可能是由功能相关的一组基因群或蛋白质群体及特异代谢组分表达异常共同构成。3、表明肝癌肝肾阴虚证存在着一组数目不多、但能恒定出现表达变化的差异基因，并且这些基因在基因共表达网络中处于显著调控地位，我们称其为显著性差异基因。4、通过显著性差异基因的mRNA与蛋白检测结果，进一步证实我们提出的关于证实质的假说，即“证”是多基因在mRNA和/或蛋白质水平发生改变并导致人体偏离正常的状态。