第一部分Nrf2基因敲除对液压冲击脑损伤内质网应激凋亡的影响及机制目的:创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)具有高致死和高致残的特点,已成为40岁以下青壮年致死致残的主要病因。目前大量研究证实内质网应激性神经细胞凋亡在创伤性脑损伤中扮演重要角色。本研究拟通过蛋白印迹法(Western Blot)检测Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠液压冲击脑损伤后Nrf2的表达及与凋亡相关的调控因子的变化,并通过流式细胞术检测神经细胞凋亡变化,探讨Nrf2基因敲除对液压冲击脑损伤抗神经细胞凋亡的影响及机制。方法:本实验采用雄性ICR种系Nrf2基因敲除纯合子Nrf2(-/-)型和野生型纯合子Nrf2(+/+)型小鼠(由河北医科大学第二医院河北省神经科学重点实验室惠赠),饲养于河北医科大学第二医院动物中心22~25°C和50~70%湿度环境下,采用近交系繁殖,12小时光/暗循环,自由进食水。实验前剪取尾尖组织提取DNA,采用PCR法进行基因鉴定,设计引物分别为:50-TGACGACTATTGAAGGCTG-30、50-CGCCTTTT CAGTAGGAGG-30和50-GGGGGACCGTAATG-GATAGG-30。选取体重30±2克雄性小鼠,Nrf2(-/-)型及Nrf2(+/+)各16只,分别随机分为2组:假手术组(sham组)8只,脑损伤组(TBI组)8只。戊巴比妥钠(100mg/kg)腹腔注射麻醉后,sham组头颅开骨窗,不行液压冲击;TBI组麻醉后头颅开骨窗,制作液压冲击脑损伤动物模型。各组在造模成功后24小时行神经功能缺损评分(m NSS),其后过度麻醉处死,冰板上快速留取脑组织,取损伤区前缘约100mg脑组织标本以干湿重法测量脑组织含水量;去除挫伤区完全破碎的脑组织,冠状切取挫伤灶范围内的的半暗带脑皮质(约2-3mm),迅速液氮冷冻,然后存储于-80℃冰箱,其后行GRP78、P-PERK、P-eif2α、ATF4、P-JNK、CHOP、GSK-3β、P-GSK-3β(Ser9)、P-GSK-3β(tyr216)、Caspase3、Caspase12、Nrf2核蛋白及胞浆蛋白Western Blot检测。同样方法制作另一组液压冲击脑损伤动物模型,处死后快速取脑,去除挫伤区完全破碎的脑组织,冠状切取挫伤灶范围内的的半暗带脑皮质,即刻行流式细胞学检测。结果:1.神经功能缺损评分(mNSS)1)TBI各组小鼠在伤后24小时出现明显神经功能缺损症状,主要表现为呼吸不规则,前/后肢的屈曲,向偏瘫侧歪斜等。Nrf2(-/-)小鼠(9.98±0.896,P<0.05)m NSS评分高于Nrf2(+/+)小鼠(9.67±0.817,P<0.05)差异有统计学意义(P<0.05)。2)TBI各组m NSS评分明显高于相应sham组,差异有统计学意义。(P<0.05)3)sham各组小鼠神经功能缺损症状不明显。2.脑组织含水量检测1)TBI各组小鼠伤后24小时,Nrf2(-/-)小鼠的脑组织含水量(82.96±0.36,P<0.05)高于Nrf2(+/+)小鼠(80.78±0.45,P<0.05),差异具有统计学意义(P<0.05)。2)sham组Nrf2(-/-)小鼠的脑组织含水量为(77.35±0.18,P<0.05),与Nrf2(+/+)小鼠的脑组织含水量(77.27±0.09,P<0.05),差异无统计学意义(P>0.05)。3)TBI各组小鼠脑组织含水量明显高于相应sham组。3.流式细胞学检测1)TBI各组小鼠伤后24小时,Nrf2(-/-)小鼠的神经细胞早期凋亡率(15.05%±0.32%,P<0.05)高于Nrf2(+/+)小鼠(11.67%±0.42%,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。2)sham组Nrf2(-/-)小鼠和Nrf2(+/+)小鼠的神经细胞早期凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。3)TBI各组小鼠神经细胞早期凋亡率明显高于相应sham组。4.Western Blot检测Nrf2:Nrf2(+/+)小鼠伤后24小时,TBI组的Nrf2核蛋白表达(0.56±0.07,P<0.05)高于sham组(0.191±0.03,P<0.05);而与之相反的是,TBI组Nrf2胞浆蛋白的表达(0.67±0.06,P<0.05)显著低于sham组(0.83±0.03,P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。Nrf2(-/-)小鼠各组无明显Nrf2表达。GRP78、P-PERK、ATF4、P-eif2α:TBI组小鼠伤后24小时,Nrf2(-/-)小鼠GRP78、P-PERK、ATF4、P-eif2α(0.84±0.06,0.88±0.08,0.73±0.11,0.47±0.07,P<0.05)的表达与Nrf2(+/+)小鼠(0.75±0.09,0.45±0.06,0.60±0.08,0.44±0.04,P<0.05)相比差异有统计学意义(P<0.05)。Nrf2(-/-)小鼠TBI组GRP78、P-PERK、ATF4、P-eif2α蛋白表达高于sham组(0.48±0.06,0.36±0.04,0.50±0.03,0.18±0.02,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05);而Nrf2(+/+)小鼠TBI组GRP78、P-PERK、ATF4、P-eif2α蛋白表达也高于sham组(0.33±0.03,0.14±0.02,0.40±0.04,0.15±0.02,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。P-JNK:TBI组小鼠伤后24小时,P-JNK的表达情况是:Nrf2(-/-)小鼠(0.74±0.05,P<0.05)与Nrf2(+/+)小鼠(0.74±0.03,P<0.05)相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Nrf2(-/-)小鼠TBI组P-JNK蛋白表达高于sham组(0.40±0.03,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05);Nrf2(+/+)小鼠TBI组P-JNK蛋白表达也高于sham组(0.40±0.02,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。CHOP:TBI组小鼠伤后24小时,CHOP的表达情况是:Nrf2(-/-)小鼠(0.80±0.06,P<0.05)高于Nrf2(+/+)小鼠(0.71±0.05,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。Nrf2(-/-)小鼠TBI组CHOP蛋白表达高于sham组(0.40±0.03,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05);Nrf2(+/+)小鼠TBI组CHOP蛋白表达也高于sham组(0.26±0.02,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。GSK-3β:GSK-3β在各组的表达均无明显差别(P>0.05)P-GSK-3β(ser9):TBI组小鼠伤后24小时,P-GSK-3β(ser9)的表达情况是:Nrf2(-/-)小鼠(0.27±0.11,P<0.05)与Nrf2(+/+)小鼠(0.26±0.02,P<0.05),差异无统计学意义(P>0.05)。Nrf2(-/-)小鼠TBI组P-GSK-3β(ser9)蛋白表达低于sham组(0.46±0.06,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05);Nrf2(+/+)小鼠TBI组P-GSK-3β(ser9)蛋白表达也低于sham组(0.47±0.10,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。P-GSK-3β(tyr216):TBI组小鼠伤后24小时,P-GSK-3β(tyr216)的表达情况是:Nrf2(-/-)小鼠(0.56±0.07,P<0.05)与Nrf2(+/+)小鼠(0.55±0.09,P<0.05),差异无统计学意义(P>0.05)。Nrf2(-/-)小鼠TBI组P-GSK-3β(tyr216)蛋白表达高于sham组(0.31±0.05,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05);Nrf2(+/+)小鼠TBI组P-GSK-3β(tyr216)蛋白表达也高于sham组(0.30±0.07,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase3、Caspase12:TBI组小鼠伤后24小时,Nrf2(-/-)小鼠Caspase3及Caspase12的表达(0.64±0.03,0.75±0.08,P<0.05)均高于Nrf2(+/+)小鼠(0.50±0.04,0.68±0.06,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。Nrf2(-/-)小鼠TBI组Caspase3及Caspase12蛋白表达高于sham组(0.35±0.02,0.39±0.03,P<0.05);Nrf2(+/+)小鼠TBI组Caspase3及Caspase12蛋白表达也高于sham组(0.33±0.03,0.27±0.02,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.液压冲击脑损伤后,内质网应激及凋亡通路标志性蛋白明显升高,神经细胞凋亡明显增多,小鼠神经功能缺损明显加重,说明液压冲击脑损伤后出现内质网应激,并诱导神经细胞凋亡。2.液压冲击脑损伤激活了Nrf2通路,Nrf2是机体防御外界损伤的反应之一;利用Nrf2基因敲除小鼠建立液压冲击脑损伤模型,模拟阻断Nrf2通路后,发现Nrf2基因敲除小鼠液压冲击脑损伤后神经细胞凋亡明显较野生型小鼠严重,说明Nrf2具有抑制内质网应激性神经细胞凋亡的作用。3.对比野生型小鼠及Nrf2基因敲除小鼠在内质网应激标志性蛋白、CHOP及JNK、Caspase12、GSK-3β凋亡通路标志性蛋白表达上的差异,发现Nrf2可通过抑制内质网应激关键蛋白的表达及CHOP、caspase12凋亡通路进而抑制内质网应激性神经细胞凋亡,但与JNK、GSK-3β凋亡通路无明显关系。4.液压冲击脑损伤后,P-GSK-3β(ser9)表达明显降低,而P-GSK-3β(tyr216)的表达出现升高,说明液压冲击脑损伤后GSK-3β通路被激活。第二部分Nrf2通路激活对液压冲击脑损伤内质网应激凋亡的影响及机制目的:探讨Nrf2通路被姜黄素激活后对大鼠液压冲击脑损伤后内质网应激诱导的神经细胞凋亡的影响并探讨其机制方法:健康成年SD大鼠24只(购于河北医科大学动物中心),体重300±50克,随机分为3组:假手术组(sham组)、脑损伤组(TBI+vehicle组)、姜黄素干预组(TBI+Curcumin组),每组8只。戊巴比妥钠(100mg/kg)腹腔注射麻醉后,sham组头颅开骨窗,不行液压冲击;TBI+vehicle组麻醉后头颅开骨窗,制作液压冲击脑损伤动物模型,麻醉清醒后立即给予腹腔注射生理盐水1ml。TBI+Curcumin组于麻醉清醒后立即给予姜黄素腹腔注射,浓度为100mg/kg。各组在造模成功后24小时行神经功能缺损评分(m NSS),其后过度麻醉处死,冰板上快速留取脑组织,取损伤区前缘约100mg脑组织标本以干湿重法测量脑组织含水量;去除挫伤区完全破碎的脑组织,冠状切取挫伤灶范围内的的半暗带脑皮质(约2-3mm),迅速液氮冷冻,然后存储于-80℃冰箱,其后行GRP78、P-PERK、P-eif2α、ATF4、P-JNK、CHOP、GSK-3β、P-GSK-3β(Ser9)、P-GSK-3β(tyr216)、Caspase3、Caspase12、Nrf2核蛋白及胞浆蛋白Western Blot检测。同样方法制作另一组液压冲击脑损伤动物模型,处死后快速取脑,去除挫伤区完全破碎的脑组织,冠状切取挫伤灶范围内的的半暗带脑皮质,即刻行流式细胞学检测。结果:1.神经功能评分与TBI+vehicle组相比,TBI+Curcumin组神经功能评分明显降低(10.763±1.357,8.073±1.263),差异有统计学意义(P<0.05)。2.脑组织含水量测定与TBI+vehicle组比较,TBI+Curcumin组脑组织含水量明显降低(82.143±0.304,78.204±0.318),差异有统计学意义(P<0.05)。3.流式细胞学检测神经细胞凋亡TBI+Curcumin组(7.7%±1.3%,P<0.05)大鼠神经细胞凋亡程度明显低于TBI+vehicle组(13.6%±2.2%,P<0.05)。差异有统计学意义(P<0.05)4.Western Blot检测Nrf2:伤后24小时,TBI+vehicle组Nrf2核蛋白(0.58±0.05,P<0.05)表达明显高于sham组(0.27±0.06,P<0.05)但低于TBI+Curcumin(0.79±0.03,P<0.05)组;而胞浆蛋白(0.63±0.07,P<0.05)的表达显著低于sham组(0.89±0.09,P<0.05),但高于TBI+Curcumin组(0.49±0.07,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。GRP78、P-PERK、ATF4、P-eif2α:伤后24小时,TBI+Curcumin组GRP78、P-PERK、ATF4、P-eif2α蛋白(0.18±0.04,0.56±0.07,0.22±0.03,0.29±0.02,P<0.05)表达低于TBI+vehicle组(0.27±0.03,0.75±0.05,0.48±0.04,0.39±0.03,P<0.05),但高于sham组(0.15±0.02,0.22±0.03,0.18±0.03,0.11±0.01,P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。P-JNK:伤后24小时,TBI+Curcumin组P-JNK蛋白(0.61±0.03,P<0.05)表达与TBI+vehicle组(0.61±0.05,P<0.05)比较差异无统计学意义(P>0.05),但二者均高于sham组(0.38±0.02,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。CHOP:伤后24小时,TBI+Curcumin组CHOP蛋白(0.40±0.02,P<0.05)表达低于TBI+vehicle组(0.43±0.04,P<0.05),但二者均高于sham组(0.27±0.02,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。GSK-3β:GSK-3β在各组的表达均无明显差别(P>0.05)。P-GSK-3β(ser9):伤后24小时,TBI+vehicle组P-GSK-3β(ser9)蛋白(0.27±0.06,P<0.05)表达明显低于sham组(0.58±0.09,P<0.05);TBI+Curcumin组P-GSK-3β(ser9)蛋白(0.39±0.06,P<0.05)表达高于TBI+vehicle组,但仍低于sham组。以上差异均有统计学意义(P<0.05)。P-GSK-3β(tyr216):伤后24小时,TBI+vehicle组P-GSK-3β(tyr216)蛋白(0.58±0.07,P<0.05)表达明显高于sham组(0.34±0.03,P<0.05);TBI+Curcumin组P-GSK-3β(tyr216)蛋白表达(0.45±0.06,P<0.05)低于TBI+vehicle组,但仍高于sham组。差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase3、Caspase12:伤后24小时,TBI+Curcumin组caspase3及caspase12蛋白(0.66±0.05,0.49±0.02,P<0.05)表达明显高于sham组(0.16±0.02,0.27±0.03,P<0.05)但低于TBI+vehicle组(0.84±0.07,0.63±0.06,P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.通过建立大鼠液压冲击脑损伤模型,姜黄素干预治疗后,Nrf2通路被激活,而相应的内质网应激性凋亡相关蛋白csapase12表达明显降低,说明Nrf2激活后对内质网应激性神经细胞凋亡具有更显著的抑制作用。该作用是通过抑制内质网应激关键蛋白的表达及CHOP、caspase12凋亡通路实现的,与JNK通路无明显关系。2.姜黄素可以促进GSK-3βser9的位点的磷酸化,而对tyr216位点磷酸化有抑制作用,进而抑制GSK-3β,这可能也是姜黄素脑保护作用的机制之一。