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围产期奶牛由于经历妊娠、分娩和泌乳启动使其处于高代谢状态,而高代谢状态则可使其处于生理性氧化应激状态。以能量负平衡为病理学基础的酮病是围产期奶牛重要的群发性常见病,其临床病理学特征是低血糖、高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid, NEFA)和高酮血症。高NEFA和高β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid, BHBA)可以通过多条途径产生大量活性氧(ROS),从而导致组织细胞发生氧化应激,损伤线粒体,造成细胞凋亡,使奶牛酮病病情更加严重和复杂化。所以揭示奶牛酮病的高NEFA、高BHBA血症与肝细胞氧化应激和凋亡的内在联系,阐明高NEFA、高BHBA血症致奶牛肝细胞凋亡的信号转导机制,对于解释奶牛酮病的发生机理和防治具有重要意义。因此本实验通过生物学和ELISA方法检测自然发病奶牛血液中常规生化指标、氧化抗氧化指标,评价亚临床酮病、临床酮病奶牛氧化应激状态及其与高NEFA血症和高BHBA血症的相关性;同时,通过奶牛肝细胞体外原代培养的方法,重点监测BHBA对肝细胞氧化、抗氧化状态的影响以及NEFA和BHBA诱导肝细胞凋亡的信号转导机制。酮病奶牛血液氧化应激状态与高NEFA血症和高BHBA血症的相关性。亚临床、临床酮病奶牛血液中脂代谢指标高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HDL)、极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein, VLDL)、总胆固醇(Total cholesterol, TC)含量降低,肝功指标天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基转移酶(Alanineamiotransferase, ALT)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活性升高,氧化应激指标丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)、氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione, GSSG)含量增加,抗氧化指标谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione-peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(Catalase, CAT)活性降低,谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、维生素C (Vitamin C, Vc)和维生素E (Vitamin E, VE)的含量减少,GSH/GSSG的比率、抑制羟自由基能力降低,且AST、ALT、LDH、MDA、H2O2、GSSG和血液中NEFA、BHBA之间存在正相关;TC、HDL、VLDL、SOD、CAT、GSH、GSH/GSSG、Vc、VE、抑制羟自由基能力和血液中NEFA、BHBA存在负相关。表明,亚临床、临床酮病奶牛存在氧化应激和一定程度的肝功能损伤,提示酮病奶牛肝功能异常可能和氧化应激有关。BHBA对体外培养奶牛肝细胞氧化应激状态的影响。体外培养奶牛肝细胞,添加BHBA(0、0.3、1.2、2.4、4.8mM)培养12、24、36h后,应用ELISA和qRT-PCR等分子生物学方法,检测奶牛肝细胞氧化应激状态相关指标GSH-Px、CAT、SOD的活性和mRNA表达水平、H2O2和MDA含量、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)、抑制羟自由基能力。结果表明,高浓度BHBA能够降低肝细胞抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性和mRNA表达水平,同时降低肝细胞中TAC和抑制羟自由基能力,升高氧化指标H2O2和MDA的水平。表明高BHBA可引起肝细胞氧化应激。BHBA通过线粒体依赖的ROS-JNK/ERK通路诱导肝细胞凋亡。在牛肝细胞培养介质中添加BHBA可诱导肝细胞发生氧化应激,ROS含量增加,从而促进c-Jun N端激酶(C-JunNH(2)-terminal kinase, JNK)活化,抑制细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulatedprotein kinase, ERK)的活化,促进抑癌基因p53的转录和表达,抑制NF E2相关因子2(NF-E2-related factor2, Nrf2)的转录和表达,上调促凋亡基因Bcl2相关蛋白X(Bcl-2-associated X protein, Bax)和Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动子(Bcl-xl/Bcl-2-associated deathpromoter, Bad)的表达,下调抗凋亡基因B细胞淋巴结基因2(B-cell lymphonma gene2,Bcl-2)、Bcl-w和B细胞淋巴结extra large(B-cell lymphoma-extra large, Bcl-xl)的表达,进而引起线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP)下降,使细胞色素C(Cytochrome c, cytc)和凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor,AIF)释放,激活半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)和多腺苷二磷酸多聚酶(PolyADP-ribose polymerase, PARP)。表明BHBA可以通过线粒体介导的ROS-JNK/ERK信号通路,促进肝细胞凋亡基因表达,抑制抗凋亡基因表达,造成肝细胞凋亡。NEFA通过线粒体依赖的ROS-JNK/ERK通路诱导肝细胞凋亡。在牛肝细胞培养介质中添加NEFA可以诱导肝细胞发生氧化应激,使ROS含量增加,从而促进JNK活化,抑制ERK活化,上调促凋亡基因Bax和Bad的表达,下调抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xl的表达,以致线粒体膜电位下降、细胞色素C和凋亡诱导因子释放,然后激活caspase3和PARP。表明NEFA可以通过调节线粒体介导的ROS-JNK/ERK信号通路关键因子的表达,引起肝细胞的凋亡。通过以上实验结果得出以下结论,酮病奶牛存在氧化应激和一定程度的肝功能异常,氧化应激与高NEFA和高BHBA血症密切相关。高浓度NEFA和BHBA通过线粒体介导的肝细胞氧化应激,激活JNK通路,抑制ERK通路,从而引起肝细胞凋亡,损伤肝脏机能。