肝纤维化是一种常见的慢性肝病,持续发展可进展为肝硬化、肝癌。引起肝纤维化发生的因素很多,包括酒精刺激、病毒感染、药物中毒、肥胖等,而肝星状细胞（HSCs）作为肝脏中最主要的间充质细胞,在肝纤维化过程中起着至关重要的作用。正常情况下,肝星状细胞为静息态,不呈现出高增殖活性、纤维化特征、炎性反应等特性;但在不同因素诱导下,星状细胞对诱因做出反应,自身被活化成为激活态,向纤维化方向转变,表现出增殖活性增强、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原（Col-1）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）等基质过量积聚等特征。肝移植是治疗肝纤维化患者的最有效的治疗方法;然而,器官供应问题往往限制这一治疗方案的推行。因此,研究肝纤维化和HSC活化的机制对于开发新的治疗方法具有重要意义。然而,目前有关肝纤维化的过程仍不十分清楚,肝星状细胞活化机制尚不完全明确。外泌体是一类细胞分泌的粒径在50-150 nm的胞外囊泡,在肝纤维化中起到重要的信息转导作用。外泌体通过包含microRNA等非编码RNA以及促进细胞间通讯的蛋白质,实现细胞与细胞间的信号传递。几乎所有的细胞都具有分泌释放外泌体的功能,如间充质干细胞源外泌体被认为是一种具有潜在的逆转纤维化的作用。激活态肝星状细胞源外泌体则通过传递糖酵解相关蛋白,从而改变靶细胞代谢而促进肝纤维化。外泌体在肝纤维化中的作用已经被大量报道证实,但有关外泌体的释放机制目前报道不多。ASK1（Apoptosis signal-regulating kinase 1,凋亡信号调节激酶 1）系 MAPK激酶（MAPKs）家族的成员,调控c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK信号通路的激活。不同的应激源,包括内质网应激（ERS）、活性氧（ROS）和脂多糖（LPS）通过促进ASK1磷酸化,从而诱导JNK和p38MAPK的激活,从而参与调节细胞增殖、凋亡和炎症。据报道,ASK1可介导肝坏死炎症和增殖与纤维化发生。已有证据表明,ASK1促进肝纤维化进展。然而,在HSC激活过程中,ASK1和ERS之间的潜在联系仍需要进一步的研究。血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）具有诱导活化肝星状细胞的功能,促进细胞向成纤维细胞方向分化。本课题将从肝星状细胞体外实验着手,通过AngⅡ诱导激活星状细胞,建立肝纤维化细胞模型,并通过细胞、蛋白、分子等方面的技术手段,旨在明确:1)验证Ang Ⅱ诱导的肝纤维化特征和引起的信号通路的改变,以及对内质网应激的影响。2)明确ASK1在肝星状细胞活化中的作用;3)阐明内质网应激介导的外泌体释放在活化肝星状细胞活化中的作用。以试图阐明激活态肝星状细胞通过ASK1通路、引起细胞内质网应激发生、调控外泌体释放,并进一步活化静息态细胞的机制。第一部分激活态肝星状细胞源外泌体介导静息态细胞活化目的:在肝纤维化细胞模型中,验证肝星状细胞活化后特征,同时初步阐明激活态细胞源外泌体对静息态细胞的活化作用这一现象。方法:1.使用Ang Ⅱ处理LX-2细胞（人肝星状细胞）,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光检测α-SMA、ColⅠ和Col Ⅲ表达水平;CCK8试剂盒（细胞活性检测试剂盒）方法检测细胞增殖活性;2.Western blot方法检测ASK1及内质网应激相关蛋白表达水平,流式细胞术检测LX-2细胞ROS产生水平;3.ELISA方法检测细胞炎性反应;4.分离获得Ang Ⅱ处理后肝星状细胞外泌体,孵育静息态细胞;同时,将激活态星状细胞与静息态细胞共培养,随后对静息态细胞α-SMA表达进行检测;5.将激活态肝星状细胞分泌的外泌体进行Annexin V封闭处理,孵育细胞后,检测静息态细胞α-SMA表达以及细胞增殖活性。结果:LX-2细胞经Ang Ⅱ处理后,α-SMA表达水平显著上调,伴随细胞增殖活性显著提高;进一步结果显示,Ang Ⅱ还具有促进ASK1表达及引起内质网应激相关蛋白表达异常、促进ROS产生以及细胞增殖活性;静息态星状细胞在和Ang Ⅱ处理后的细胞共培养或经其外泌体孵育后,α-SMA表达增强;进行Annexin抗体封闭处理后的外泌体则无法使静息态细胞发生活化。小结:1.Ang Ⅱ可促进肝星状细胞增殖,并激活肝星状细胞发生纤维化;2.Ang Ⅱ引起ASK1表达上调,并引起内质网应激、ROS产生以及炎性反应;3.活化肝星状细胞可进一步诱导静息态肝星状细胞活化,这种促进作用,可能与其分泌的外泌体被静息态细胞摄取有关。第二部分ASK1介导内质网应激参与肝星状细胞活化目的:探索ASK1在Ang Ⅱ诱导的肝纤维化大鼠模型中的作用,并验证内质网应激、外泌体在肝星状细胞由静息态向激活态转变中的作用机制。方法:基于AngⅡ诱导的体外模型中1.使用ASK1抑制剂（GS-4997）和ASK1 siRNA处理细胞作为处理组,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光检测α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ表达水平;CCK8试剂盒方法检测细胞增殖活性;Western blot方法检测ASK1及内质网应激相关蛋白表达水平,流式细胞术检测LX-2ROS产生水平;ELISA方法检测细胞炎性反应;分离获得各组肝星状细胞外泌体,孵育静息态细胞;同时,将各组肝星状细胞与静息态细胞共培养,随后对静息态细胞α-SMA表达进行检测;2.使用ASK1抑制剂作为处理组,同时使用内质网应激诱导剂衣霉素、外泌体释放抑制剂处理细胞,进行与1)中相同的检测。结果:1.GS-4997或ASK1 siRNA处理后,肝星状细胞LX-2 α-SMA表达水平出现明显下调,细胞增殖活性显著减弱;细胞内质网应激相关蛋白减弱,ROS减少降低,;共培养下的静息态细胞活化作用减弱,同时,所分泌的外泌体对静息态细胞的活化作用也出现降低现象;2.经衣霉素处理后,GS-4997对肝星状细胞LX-2的抑制内质网应激、ROS产生和炎性反应的抑制作用均得到逆转而增强,,而对应组别细胞外泌体对静息态细胞的活化作用也出现增强;而进一步的外泌体释放剂没有影响星状细胞自身的内质网应激、ROS产生以及炎性反应,但对其外泌体作用下的静息态细胞相较于衣霉素处理组有明显的活化减弱的现象。小结:1.ASK1在Ang Ⅱ引起的肝星状细胞活化中,起到关键的调控作用,并可对细胞内质网应激、ROS产生、炎性反应起到重要促进作用;2.激活态肝星状细胞源外泌体介导静息态细胞的活化;3.内质网应激通路是ASK1介导的星状细胞活化作用中的关键一环。第三部分ASK1介导肝组织内质网应激调控外泌体释放活化静息态肝星状细胞目的:建立大鼠肝纤维化体内模型,验证ASK1介导的内质网应激在肝纤维化中的作用,探索血清外泌体对静息态细胞的活化作用。方法:1.使用四氯化碳油溶液腹腔注射建立大鼠肝纤维化模型,使用ASK1抑制剂GS-4997作为药物进行治疗,Western blot检测肝组织中ASK1、α-SMA、内质网应激相关蛋白表达水平,H＆E染色和Masson染色检测肝脏病理及纤维化情况;免疫组化检测ASK1表达水平;检测血清ALT和SOD水平;2.分离获得各组动物血清外泌体,孵育静息态细胞后,检测细胞被活化的情况。结果:1.结果显示,模型组动物肝脏ASK1表达水平上调,ALT水平上调,SOD水平下降,H＆E染色结果显示,模型组肝脏有大量炎性细胞浸润,Masson染色结果显示,模型组动物肝脏组织的高度纤维化,且组织中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ表达增强;内质网应激发生在模型组肝脏中增强。而在经过GS-4997处理后,上述现象均得到不同程度的逆转;2.各组动物血清外泌体粒径在100 nm左右,表达CD63和TSG101蛋白,将各组动物外泌体与静息态细胞进行共培养后,静息态细胞α-SMA表达水平下调。小结:1.ASK1抑制剂可抑制大鼠肝纤维化的进展,并使内质网应激信号减弱;2.肝纤维化大鼠模型血清源外泌体可调控体外静息态肝星状细胞的活化。结论 1.肝星状细胞在Ang Ⅱ处理后,呈现出纤维化特征,同时,ASK1表达水平和内质网应激受到促进作用;2.经Ang Ⅱ处理后的肝星状细胞分泌的外泌体,具有诱导静息态细胞活化的作用;这种作用依赖ASK1介导的内质网应激发生;对外泌体释放途径进行阻断可抑制星状细胞活化;3.ASK1抑制剂GS-4997具有抑制肝纤维化的作用,并具有潜在的治疗肝纤维化进展的治疗作用;这种作用可能是通过调控外泌体的释放所介导的肝星状细胞活化而实现的。