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耐多药结核的蔓延已经严重威胁了结核病的防控。据世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)统计,2013年全球新增结核病人900万,150万人因此丧生。新增患者中,约有48万人为耐多药结核病患者。医院常用的结核分枝杆菌及其耐药性检测方法如:LJ培养法费时费力,延误了病人的诊断和用药。这是导致耐多药结核蔓延的重要原因之一。尽管近几年人们开发出了很多结核病和药敏检测的新方法,但是很少研究能够解决结核分枝杆菌吡嗪酰胺(PZA)耐药性检测的难题。PZA需要在酸性条件下才能起到杀菌作用,而酸性的培养条件会抑制结核菌的生长。因此,利用培养法对结核分枝杆菌进行PZA耐药性检测存在很大的困难。 本研究主要内容包括:⑴建立了一种可以直接从临床痰液样本中检测结核分枝杆菌并进行PZA耐药检测的新方法。本研究利用长片段扩增荧光定量PCR技术扩增ncA基因。阳性的扩增结果表明痰液中含有结核分枝杆菌。将扩增的片段测序后与结核病耐药突变数据库比对,未发生突变则认为菌株为PZA敏感株,已知突变则按照数据库判断药敏情况。对于未知的新发突变则利用体外表达吡嗪酰胺酶的方法测定PZA耐药性。这种新方法可以在3.5h之内检测出结核分枝杆菌,检测线为7.8个菌每次反应,并且2d内就可以取得PZA的药敏结果。利用该方法对213个临床痰液样本进行检测,检测出53株阳性样本。通过与结核分枝杆菌培养法相比较,该方法灵敏度和特异性分别达到了92%和97%。通过对测序结果的比对我们发现,在这53株阳性样本中,49株样本为pncA基因没有发生突变的PZA敏感株。有4株样本的pncA基因发现了突变,其中1株为已知的耐药突变,另外3株经过体外表达吡嗪酰胺酶的方法测定后认定1株为敏感株,2株为耐药株。这种联合检测的新方法避免了菌株的培养,因而快速、安全、廉价、适合在资源较匮乏的国家和地区使用。⑵建立了一种基于培养的PZA耐药检测方案。该方案利用CTC(5-氰基-2,3-二-(p-苄基-四唑氯化物)),一种单四唑氧化还原染料作为生长指示剂来检测PZA耐药性。经过PZA处理3d的结核分枝杆菌离心去除PZA,沉淀用CTC重悬后放入37℃培养箱,肉眼观察检测管的颜色变化。没经过PZA处理的菌株,测试管很快就能产生红色沉淀,证明菌株具有较强的活力。经过PZA处理的耐药菌株,代谢活性不受PZA的影响,也会很快产生红色沉淀。敏感菌株测试管则始终保持几乎无色。我们利用该方法对50株临床样本进行了PZA耐药性检测。结果表明,该方法可以在4-6 d内给出结核分枝杆菌的PZA耐药结果。与BACTECMGIT960方法相比较,具有很高的灵敏度(97.1%)和较好的特异度(81.3%)。