实验目的壁虎应用于临床抗肿瘤疗效确切。诱导分化抗肿瘤疗法具有毒性小,疗效好的优点。本课题组前期实验结果表明壁虎粗提液、G25峰1、离子组分以及疏水组分等壁虎分离组分体内具有很强的抗肿瘤活性;壁虎粗提液体外有诱导人肝癌细胞Bel-7402诱导分化的作用。在此基础上,进一步研究壁虎活性分离组分诱导分化的分子机制。此外,结合形态学观察和体外抑瘤活性检测从疏水组分中进一步筛选壁虎活性单体。试验方法1形态学观察:采用倒置显微镜法和Gimesa染色法观察壁虎活性组分对细胞形态变化的影响。2体外抑瘤活性:通过MTT法检测壁虎各分离组分的体外抑瘤作用。3生化指标的测定:B16细胞:96孔板比色法测定黑色素含量。Bel-7402细胞:放射免疫法检测甲胎蛋白(AFP)的含量;溴甲酚绿法检测白蛋白(ALB)的含量;生化试剂盒检测γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)的活性。4 采用Western blot方法检测细胞周期蛋白CDC2、MAPK信号通路关键蛋白(P38,P-P38,ERK1/2、P-ERK1/2、JNK1/2、P-JNK1/2)以及下游核转录因子 NF-κB 的表达。实验结果1壁虎粗提液诱导分化的分子机制研究形态学观察发现,壁虎粗提液作用后B16细胞和Bel-7402细胞形态均表现出诱导分化的变化,B16细胞两极树突延长,细胞分散生长;Bel-7402细胞也呈离散型生长,细胞变成长条形或不规则形状,部分细胞个体增大。生化指标结果表明壁虎粗提液作用Bel-7402细胞后,AFP分泌降低,ALB分泌增加,y-GT和ALP活性降低,且作用效果均呈现剂量依赖性;而壁虎粗提液作用于B16细胞后,用96孔板比色法检测黑色素分泌量,多次实验结果发现药物对吸光度有很大干扰作用。因此选择Bel-7402细胞用于后续的实验研究。体外抑瘤活性实验表明粗提液体外能抑制Bel-7402细胞的生长,且有剂量效应。对细胞周期和信号转导通路的实验结果表明,壁虎粗提液能降低细胞周期蛋白CDC2的表达,但无显著性(P>0.05)。对MAPK信号通路关键蛋白P38、ERK1/2、JNK1/2总蛋白的表达无显著性影响;对其激活形式P-P38和P-JNK1/2的表达也无显著作用,并且可能由于含量太少,Western blot法很难检测到;但是壁虎粗提液作用后P-ERK1/2的表达显著增加,且有时间和剂量依赖效应,加药浓度越高,时间越长,P-ERK1/2蛋白表达量越多,同时发现加药30min后P-ERK1/2基本达到一个稳定的表达水平,至72 h表达量仍比较高。MEK1/2和壁虎粗提液联合用药组细胞P-ERK1/2表达很少,甚至检测不到,进一步说明壁虎粗提液激活了 Bel-7402细胞内ERK1/2的活性。2壁虎G25峰1组分诱导分化的分子机制研究根据壁虎粗提液诱导分化的结果,选用Bel-7402细胞,从形态学、生化指标、体外抑瘤活性方面考察,发现G25峰1的作用效果与粗提液作用效果一致。说明G25峰1体外有诱导Bel-7402分化的作用。对细胞周期和信号转导通路的实验结果表明,G25峰1作用后,同样对细胞周期蛋白 CDC2,MAPK 信号通路关键蛋白 P38、ERK1/2、JNK1/2、P-P38 和 P-JNK1/2 等无明显作用,但能激活ERK1/2,促进P-ERK1/2的持续表达。实验进一步研究了 ERK1/2通路下游核转录因子NF-κB总蛋白的表达,发现G25峰1作用前后,其表达无明显变化。3对离子组分的体外抗肿瘤活性检测壁虎离子组分体外实验表明未冻干离子组分和冻干离子组分均有抑制肝癌细胞生长的作用,也有剂量效应,冻干组分的效果更好一些。但与粗提液、G25峰1组分相比,作用效果并不理想,一是达到相同的抑制率需要更高的药物浓度,二是细胞形态学观察形态变化不太明显。因此,未对壁虎离子组分进行生化指标和分子机制的研究。4壁虎疏水组分(SS)诱导分化的分子机制研究根据壁虎粗提液和G25峰1诱导分化的实验结果,同样选用Bel-7402细胞,从形态学、生化指标、体外抑瘤活性方面考察,发现SS的作用效果与粗提液和G25峰1 一致。说明SS体外诱导Bel-7402细胞分化。对信号转导通路的实验结果表明,SS作用后,同样能激活ERK1/2,促进P-ERK1/2的持续表达。5从壁虎疏水组分中分离壁虎活性单体采用体外观察加药后Bel-7402细胞形态变化结合抑制率的方法,从疏水组分中进一步筛选抗肿瘤活性单体。通过收集疏水组分过液相后的不同时间的样品,筛选活性强的组分,最初两次实验表明④号组分活性比较强,但是当继续重复时,却得不到有活性的组分了,可能是分离方法的不稳定性或者是用PEG浓缩样品时破坏了活性成分。进一步采用冷冻干燥的方法浓缩样品,证明还是④号组分活性最强,但与其他四个组分相比,差异不是很大,猜想采用液相方法分离活性单体可能并不是一个很好的方法。采用70℃和100℃处理疏水组分,其活性与疏水组分相比差异不大,都具有明显的抗肿瘤作用,说明有效的抗肿瘤活性物质是耐高温的。结论壁虎粗提液、G25峰1、疏水组分体外能诱导人肝癌细胞Bel-7402细胞分化,抑制Bel-7402细胞的生长,其作用机制很可能是通过激活ERK通路,促进P-ERK1/2的持续表达。离子组分体外有抑制肿瘤细胞生长的作用,冻干组分效果比未冻干组分效果好。采用高效液相的方法从疏水组分中进一步分离活性单体,效果不稳定。