乳腺癌是人类常见的一种恶性肿瘤，也是女性主要恶性肿瘤之一。手术、放疗、化疗构成了肿瘤治疗的三大模式。在现代分子生物学和基因工程技术飞速发展的推动下，肿瘤的生物学治疗日益受到人们的重视，显示出良好的应用前景，成为肿瘤治疗的第四模式。肿瘤的自杀基因治疗是近年来基因治疗中研究的热点，也是目前常用的基因治疗方法。 本实验将处于Tet基因调控系统调控下的HSVtk基因插入腺相关病毒载体中，构建两个重组腺相关病毒：AAV／TRE／HSVtk／Tet-On和AAV／TRE／HSVtk／Tet-Off，并研究它们在乳腺癌基因治疗中的作用。首先，使用PCR技术从pRevTet-On／pRevTet-Off扩增Tet-On／Tet-Off基因片段，回收Tet-On／Tet-Off基因片段，以ClaⅠ和HpaⅠ消化后定向克隆插入质粒pRevTRE／HSVtk中相应的酶切位点，通过酶切、PCR鉴定筛选阳性重组质粒，再以XhoⅠ和ClaⅠ酶切该质粒，将含有HSVtk基因和Tet-On／Tet-Off调控序列的片段插入pAAV-MCS中后，经部分酶切除去不受Tet-On／Tet-Off调控序列调控的P_CMV启动子，然后经过Klenow DNA聚合酶末端补平、自身环化形成相应的重组腺相关病毒载体。重组腺相关病毒载体后，将所构建的重组载体与其辅助质粒以磷酸钙共沉淀的方法转染HEK293包装细胞，转染后的细胞经反复冻融收集病毒颗粒。以CsCl₂密度梯度离心法纯化所得的重组腺相关病毒，最后得到两株重组腺相关病毒AAV／TRE／HSVtk／Tet-On和AAV／TRE／HSVtk／Tet-Off，病毒的物理滴度分别为2.37×10¹¹／ml和3.86×10¹¹／ml。以病毒感染宿主细胞MCF-7后，提取细胞基因组DNA，进行斑点杂交检测，发现该重组病毒能够将目的基因整合到MCF-7细胞基因组中。硕士学位论文 中文摘要 此外，还将所构建的pRevTRE／HSVtlUltton质粒以脂质体方法转染 MCFj细胞，经过 Hygromycin B筛选，建立了一株稳定的受四环素衍生物强力霉素（Doxcycline，Dox）调控HSVtk基因表达的乳腺癌细胞株MCF／TRE／HSVtklTeton。用RTICR的方法检测不同Dox浓度下HSVtk基因的表达；以MTT法检测不同DOX浓度下两氧鸟苦 （Ganciclovir，GCV）对乳腺癌细胞的杀伤作用。结果表明HSVtk基因产物可以将无毒性的GCV转变成一种有毒的代谢产物，从而杀死乳腺癌细胞。该基因的表达受到Tet－On基因调控系统的调控，由强力霉素调节HSVtk基因表达。