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炭疽致死毒素能够杀伤特定来源的近交系小鼠的巨噬细胞。已知炭疽致死因子(LF)能够特异性酶切MAPKKs的N端造成MAPK信号通路的紊乱并促使细胞内炎性体的生成。目前尚不清楚LF如何使敏感的小鼠巨噬细胞发生快速裂解。目前用于研究的LF的来源并不统一,包括天然提取的LF以及从Escherichia coli,Bacillus subtilis,B. anthracis等重组表达所得,各种方法获得的LF活性差异较大,有时可相差3倍。LF在细胞内发挥其生理作用遵循蛋白质N端规则,表明其N端的氨基酸序列对其稳定性有显著影响。为获得具有完整N端的无标签重组LF,从炭疽芽孢杆菌减毒株A16R扩增了LF基因,构建了pAS22-LF质粒并转化入E.coli DH5?中,经扩增菌体,IPTG诱导,高渗休克法裂解细胞壁释放蛋白,再经4步纯化得到纯度大于90%的LF蛋白。经Western Blot检测证明所表达蛋白为LF。经过质谱分子量测定所获得LF分子量为90KD,与LF理论分子量一致。N端氨基酸序列测定结果显示N端序列与天然LF N端序列一致。HPLC纯度测定表明所获得LF蛋白及其突变体LF E687A纯度均大于90%。内毒素用鲎试剂检测原液为阴性,表明内毒素含量低于0.5EU/ml。在细胞攻毒试验中,纯化LF的LC50小于1ng/ml。这一LF的标准化工作为下一步研究LF在细胞内作用机制奠定了物质基础。已知LF作用于Nalp1bS小鼠巨噬细胞能够诱导细胞快速裂解,从LF进入胞质依次发生MEKs N端或其它分子的酶切、蛋白酶体切割未知蛋白、线粒体功能紊乱、K+外流、caspase-1炎性体的激活、细胞膜透化作用和细胞裂解并伴随着IL-18和IL-1?的释放。已知caspase抑制剂和蛋白酶体抑制剂可以保护细胞免受LT所带来的细胞裂解,蛋白酶体抑制剂抑制caspase-1激活的上游事件而抑制caspase-1的激活。Caspase信号通路与蛋白酶体之间在小鼠巨噬细胞快速裂解这一现象中有什么联系仍然知之甚少。蛋白酶体作用于什么蛋白而使caspase-1激活受到抑制对于研究LF对细胞的杀伤具有重大意义。我们选择对LT敏感的J774A.1细胞作为研究对象,分别对LT攻击过的J774A.1细胞的caspase-1,3/7等分子进行了研究,发现LT诱导J774A.1细胞裂解前期caspase-1的活性在15分钟时快速升高并一直维持至75分钟左右,而caspase-3/7的活性和PA+LF E687A相比差异没有统计学意义。而Annexin V和PI双染色以及流式细胞仪检测同样发现没有caspase-3/7的激活。可以认为,在LT诱导的巨噬细胞快速裂解的过程中,不需要caspase-3/7为中心的细胞凋亡通路的参与,而与caspase-1的激活有关。我们发现常用的抑制LF杀伤细胞的蛋白酶体抑制剂MG-132和lactacystin均能有效抑制NF-κB信号通路的激活。于是我们检测NF-κB信号通路在受LF攻击时各成员分子的变化。通过Western Blot及磷酸化水平的检测,发现NF-κB信号通路在受LF攻击时在很短时间内被显著激活。我们在细胞被LT攻击后不同时间点加入NF-κB抑制剂,发现BAY11-7082 NF-κB抑制剂可以在LT作用前期给予细胞一定的保护效果。但其作用时间有限,30分钟后对细胞保护效率大大降低。受LT攻击的J774A.1细胞的裂解是一个非常快速的过程,在细胞裂解前内部发生了怎样的变化导致了细胞不可避免的裂解,或者说为这一裂解做了哪些准备是我们研究的目的之一。另外线粒体在LT攻击中受损的情况与细胞的快速裂解密切相关,而细胞核在细胞受损时是变化最晚的细胞器之一,这些细胞器在LT攻击中的变化情况同样值得研究。为了分析J774A.1细胞裂解前后蛋白质水平的变化,我们在先前工作的基础上对正常J774A.1细胞和受LT攻击50%存活的J774A.1细胞分别进行了亲水/疏水膜蛋白、线粒体蛋白、细胞核蛋白的提取,并对每一组分进行了双向电泳分析。经PDquest软件分析,挑选分别上调或下调2倍的蛋白差异点进行胶内酶切,然后进行肽质量指纹图谱(PMF)检测,共检测出32个蛋白。这些蛋白包括细胞应激类、细胞能量代谢类及细胞骨架类,反应了细胞在受到LT攻击后成熟细胞因子产生急剧增长、过氧化物产生增多、能量代谢障碍和细胞骨架受损。另外我们检测到两个蛋白与NF-κB信号通路有关,一个是表达上调的valosin containing protein p97(VCP),一个是降低的high mobility group protein B1(HMGB1),前者能够在细胞内与IκB-α形成复合物促进蛋白酶体对IκB-α的降解激活NF-κB通路。HMGB1是细胞核内高度保守的非组DNA结合蛋白,是细胞的内源性危险信号,当细胞受到胁迫或坏死时,HMGB1释放到胞外,通过单核巨噬细胞等表面高度糖基化作用终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)和TLR(Toll like receptor)活化了NF-κB的转录。通过上述实验结果,我们认为LT攻击小鼠巨噬细胞J774A.1时NF-κB信号通路被激活,使细胞在短暂的时间内受到caspase-1炎性体激活的炎性细胞因子作用,导致细胞内针对炎性反应的对抗措施失效而导致胞内溶酶体膜透化作用释放组织蛋白酶最终使细胞裂解。