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研究背景和目的恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma, MPM)是一种少见的胸膜部侵袭性肿瘤,预后极差。它的发病通常与接触石棉有关,尽管自19世纪70年代以来石棉的使用广受限制,但接触后的长期潜伏期使间皮瘤的发病率正持续上升。预计在2010-2020年间,工业发达国家恶性间皮瘤的死亡率将达到高峰。根据组织形态学分类,MPM可分为上皮型、肉瘤样型(纤维型)和混合型三种类型,以上皮型多见。本病传统治疗效果差,确诊后中位生存期约为10-12个月。因此,对MPM有效的诊疗措施亟待研究。近些年来,基因靶向治疗在肿瘤领域的成功应用为MPM寻求有效的治疗方法奠定了基础。Numb是生物体内最重要的细胞命运决定因子之一,被认为参与多种恶性肿瘤的形成,被认为是颇具希望的抑癌基因。Numb是一种膜相关蛋白,其结构包含一个磷酸酪氨酸结合域(phosphotyrosine binding, PTB)和一个富脯氨酸域(proline rich region, PRR);靠近氨基端的PTB域是Numb作用的关键部位,可与E3泛素连接酶Mdm2,Lnx,Siahl,Itch相互作用(能够将目的蛋白质多聚泛素化,进而被蛋白酶体降解)。在Numb与肿瘤形成的研究中发现,Numb通过参与维持细胞极性和不对称分裂,上皮间质转化,蛋白质泛索化降解,抑制Notch, Hedgehog-Gli(简称Hh-Gli或Hh)信号传导通路,上调P53活性而广泛参与细胞增殖与分化、凋亡与再生等肿瘤发生的众多重要的病理生理过程,发挥其抑制肿瘤形成的作用。最近的研究表明,Numb在乳腺癌,非小细胞肺癌,唾液腺癌,成神神管细胞瘤等某些人类肿瘤中都有不同程度的表达缺关；在对人小脑髓母细胞瘤的研究中发现Numb能够通过介导Itch依赖的泛素化降解Glil,从而抑制Hh-Gli通路。然而,Numb在MPM中的表达、对Glil的调控作用以及Numb与肿瘤形成的关系尚未见报道。为了探讨Numb在MPM发生、发展中的作用,进一步以Numb为靶点进行基因治疗提供理论依据,本论文从以下三个方面进行了研究：一. Numb.Gli1在MPM组织中的表达及其临床意义：二. Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达及对Glil的调控作用；三.过表达Numb对NCI-H2452细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响。实验方法一.探讨Numb.Gli1在MPM组织中的表达及其临床意义免疫组织化学法检测Numb.Gli1在6l例MPM组织及22例正常胸膜组织中的表达,卡方检验进行组间比较；Kruskal-Wall i s或Mann-Whitney法检测Numb、Gli1在MPM中表达与临床病理参数之间的关系；Spearman等级相关分析检验Numb与Gli1的相互关系；Kaplan-Meier法log-rank检验进行单因素生存分析,Cox回归进行多因素生存分析,检测Numb、Gli1及各项临床病理参数对预后的影响。二.研究Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达及对Glil的调控作用1.首先用qRT-PCR及Western blot方法检测了Numb在NCI-H2452细胞中的表达,同时我们将已被证明表达Numb的人胚肾细胞293T作为对照；Western blot方法检测蛋白酶体抑制剂MG132作用于NCI-12452细胞后对Numb蛋白表达的影响。2.Numb农达载体体外瞬时转染NCI-H2452细胞,Western blot方法检测Numb、Glil?达；蛋白酶体抑制剂MG132作用于Numb转染组,Western blot方法检测对Gli1表达的影响。三.检测过表达Numb对MPM细胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化疗敏感性的影响1.为检测过表达Numb对NCI-H2452细胞增殖能力的影响,分别于转染后48、72h采用MTT法检测细胞存活率。2.为检测过农达Numb对NCI-H2452细胞凋亡的影响,转染后72h采用Hoeehst染色和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分别检测细胞凋亡形态的变化和凋亡率。3.为研究Numb促进NCI-H2452细胞调亡的机制,采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白caspase3,9以及细胞色素C、XIAP、survivin的变化。4.为了进一步确定Numb对MPM化疗敏感性的影响,过表达Numb后分别加入3种不同的化疗药物顺铂、培美曲塞、卡铂作用24h,采用MTT方法检测细胞存活率。结果一. Numb. Gli1在MPM组织中的表达及其临床意义Numb阳性表达率在MPM组明显低于正常对照组(P<0.05)；MPM组织中Numb表达与Ki-67标记指数密切相关,Ki-67<25%的患者中Numb表达强,Ki-67>25%的患者中Numb表达弱(P<0.05)。Glil阳性表达率在MPM组明显高于正常对照组(P<0.05)；Glil胞核表达与IMIG分期密切相关,IMIG分期为初期的患者Glil表达弱,进展期的患者Glil表达强(P<0.05)。在MPM组织中,Numb表达与Glil胞核表达呈显著负相关(r=-0.361,P<0.05)；Kaplan-Meier法log-rank检验进行单因素生存分析,结果显示在MPM组织中Numb表达缺失与预后不良有关(P<0.05)；此外,病理类型中的上皮型较之于非上皮型为有利预后因素(P<0.05)。Cox回归模型分析显示只有病理类型为独立的预后因素(HR=1.952,95%CI1.044,3.48P<0.05)。二. Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达及对Glil的调控作用1. Numb在MPM细胞株NCI-H2452中的表达结果显示NumbmRNA在NCI-H2452和293T细胞表达水平相似,但在蛋白水平,Numb在NCI-H2452细胞中的表达明显低于293T。经蛋白酶体抑制剂MG132作用后,Numb蛋白表达明显升高,提示Numb在NCI-H2452细胞中低表达或表达缺失与转录后抑制有关。2.在NCI-H2452细胞中过表达Numb后Glil蛋白表达受到抑制Numb蛋白在Numb转染组中表达明显高于空载体对照组,外源性表达Numb成功。Gli1mRNA在Numb转染组和空载体对照组比较无明显差异：而Glil蛋白在Numb转染组较之于空载体对照组表达降低,提示Numb抑制了Glil蛋白表达。蛋白酶体抑制剂MG132作用于Numb转染组后,Gli1蛋白表达恢复,提示在MG132作用下Numb对Glil蛋白抑制作用消失。三.过表达Numb对MPM细胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化疗敏感性的影响1.过表达Numb后NCI-H2452细胞增殖受到抑制MTT检测结果显示转染外源性Numb基因48、72h后,Numb转染组与空载体对照组或空白对照组比较,OD值明显降低,结果有显著性差异(P<0.05,P<0.01)提示过表达Numb能够抑制NCI-H2452细胞增殖活力。2.过表达Numb促进NCI-H2452细胞的凋亡转染外源必忖Numb基天72h后,Hoechst染色在荧光显微镜下观察发现Numb转染组细胞凋亡显著,出现明显的核固缩,核碎裂,而空载体对照组和空白对照组凋亡细胞相对较少；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)显示,Numb转染组与空载体对照组或空白对照组比较,凋亡率明显升高,结果有显著性差异(均P<0.01),提示过表达Numb舌,促进NCI-H2452细胞凋亡。3. Numb通过激活caspase-9介导的内源性凋亡途径促进NCI-H2452细胞凋亡Western blot结果显示同空载体对照组比较,Numb转染组细胞caspase-3,9活性蛋白和胞质细胞色索C表达明显升高,XIAP survivin表达减弱。提示Numb可能通过激活细胞色素C/caspase-9介导的内源性调亡途径促进NCI-H2452细胞凋亡。4.过表达Numb增强NCI-H2452细胞对顺铂和卡铂的化疗敏感性。MTT检测结果显示在相同浓度顺铂或卡铂作用下,Numb转染组的细胞存活率明显低于空载体对照组和空白对照组(P<0.05,P<0.01)；过表达Numb(?)培美曲塞作用的3组细胞存活率无明显影响。提示过表达Numb增强NCI-H2452细胞对铂类化疗药物的敏感性。结论1. Numb在MPM组织中的表达减弱甚至缺失,并且与高Ki-67标记指数及不良预后常切相关。2.Glil在MPM组织中表达增强,成IMIG分期相关；Numb与Glil表达负相关,Numb(?)能通过泛索-蛋白酶体途径抑制Glil蛋白的表达。3.过表达Numb能够抑制MPM细胞的增殖能力,并通过caspase-9介导的的内源性调亡途径促进MPM细胞的凋亡4.过农达Numb能够增强MPM细胞对铂类化疗药物的敏感性。创新性和意义1.本课题首次发现Numb在MPM组织中表达减弱甚至缺失,并且为预后不良的指标。2.本课题首次在MPM中研究了Numb与Glil的相关性及Numb对Glil的调控作用。3.本课题首次在MPM中研究了Numb对肿瘤细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响,为以Numb为靶点进行基因治疗提供了理论依据。