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1.实验一糖尿病性巨噬细胞损伤的体外模型目的：建立糖尿病巨噬细胞损伤模型。方法：以梯度D-半乳糖(D-gal,3.5-224.0 mM, k=0.5)诱导巨噬细胞损伤,RAW246.7培养梯度时程(24.0-72.0 h,k≈0.56)；MTT法检测细胞代谢活力与LDH酶活性检测细胞坏死。以D-gal降低细胞代谢活性,确定半效抑制时程(IC50)；以造模指数(PδLDH/PδMTT转化数据),回归细胞活力半效抑制剂量(IC50)。结果:D-gal诱导培养巨噬细胞损伤。D-gal导致氧化损伤的IC50为171.7 mM [62.5-471.6mM, R=0.97, y=0.7213+0.9747/(1+10(5.5964-2.504x))];ET50为48h。结论：D-gal诱导巨噬细胞氧化应激损伤,可看作糖尿病并发症的病机模型。2.实验二糖尿病痴呆的细胞模型目的：建立糖尿病性痴呆(diabetic dementia,DD)发病环节的体外模型。方法：以共培养为观察对象。①共培养：不同密度与时程,培养内皮(103.5-106,k=0.316；36-384h,k≈0.75)或巨噬细胞(102.5-105,k=0.316；36-384h,k=0.75)；HE染色,计数细胞,接触性抑制回归接种密度。②内皮直接损伤：梯度D-gal(10-103mM,k=0.56)梯度时程(24.0-72.0 h,k≈0.56)培养HUVEC损伤,MTT检测细胞活力,回归各终点内皮直接损伤的半效剂量(MD5o)。③内皮间接损伤：96孔板内皮贴壁(1.06×104/m1),24h,追加梯度(1.7×103-1.0×105/ml,k=0.56)巨噬细胞,24h后D-gal(171.7mM)氧化应激损伤,共培养96h,MTT检测细胞活力,ELISA检测ET-1,Griess-Reagent检测NO；回归内皮半效损伤的巨噬细胞最适接种密度(ED50)。结果：①共培养：内皮接种密度为3.16×104/ml。②内皮直接损伤D-gal诱导内皮损伤48h MD5o为277.3 mM,方程为y=-0.02509+1.1191/(1+10(5.245-2.147x),R=0.99。③内皮间接损伤：内皮损伤的巨噬细胞密度DD5o为1.33×103/ml,方程为y=0.1104+1.0846/(1+10(0.15933-1.559x)),R=0.96。糖尿病痴呆双细胞对话的造模条件为,内皮接种(104/m1),24h后,追加巨噬细胞接种(1.33×104/ml),D-gal 171.7mM,单板共培养96h。结论：诱导巨噬细胞醛糖还原酶,导致共培养内皮损伤,释放收缩物,可看作DD模型。3.实验三 钩藤饮单体防治糖尿病痴呆的药效验证目的：确认钩藤饮单体防治DD发病环节的直接药效。方法：在共培养阶段,5梯度(k=0.56)钩藤饮6单体分别治疗共培养‘’DD"。MTT检测细胞活力,ELISA检测ET-1,Griess-Reagent检测NO;ET-1/NO效能比,回归逆转DD始动环节的单体半效浓度(IC50)。其中,芹菜素为0.1-10 nM,钩藤碱,绿原酸,木犀草素与丹皮酚5单体的剂量区间为0.32-31.65nM；芦丁为10-1000nM。结果：针对DD始动环节造模,6单体防治DD的IC50分别为芹菜素0.6147 nM (y=0.2783+0.601/(1+10(-1.09+5.156x)),R=0.97),钩藤碱1.322 nM [y=0.9324/(1+10(0.1558-9.544x))， R=099],绿原酸1.766 nM [y=0.080+0.818/(1+10(0.7921-3.208x)),R=0.98],丹皮酚3.339 nM [y=0.0673+0.867/(1+10(80844-15.44x)),R=0.99],木犀草素9.387 nM [y= 0.1762+0.8238/(1+10(15.5989-16.04x)),R=0.97]和芦丁103.7 nM [y=0.1415+0.8494/(1+10 (24.2726-12.04x)),R=0.97]。结论：钩藤饮6单体有效逆转DD始动环节,巨噬细胞氧化致内皮损伤,收缩物引发神经血管脱偶联；保护强度依次为芹菜素,钩藤碱,丹皮酚,芦丁,绿原酸与木犀草素。4.实验四钩藤饮防治糖尿病痴呆的药理机制目的：探索与验证钩藤饮防治糖尿病痴呆的可能机制。方法：①离体确认：共培养模型分为对照组,模型组与治疗组；治疗组包括芹菜素,钩藤碱,丹皮酚,芦丁,绿原酸与木犀草素6单体分子。免疫组化显示AR原位蛋白,实时定量RT-PCR检测AR基因表达,western blot检测AR蛋白总量；t检验比较组间差异。②在体验证：7周龄db-/db-小鼠随机分9组,对照组饲标准饲料,模型组饲高脂饲料,治疗组造模同时灌胃钩藤饮浸膏7个梯度剂量。连续给药56d取材,HE染色观察脑组织病变,免疫组化显示脑组织中AR和SOD3的细胞定位,形态计量原位表达水平。回归钩藤饮降低AR或升高SOD3的量效。结果：①钩藤饮6单体降低DD始动环节模型AR原位蛋白,基因表达和蛋白含量。②钩藤饮剂量依赖性下调DD小鼠AR(ED50为150.60mg/kg,方程为y=0.12+0.82[1+10(-5.71+2.62x)],R=0.98)；上调SOD3(ED50为17.12mg/kg,方程为y=-0.02+0.84[1+10(1.62-1.31x)],R=0.91)。结论：①“降低AR诱导性表达”参与钩藤饮防治DD的药效机制。②“控制氧化损伤,下调AR/SOD3表达,逆转NVUC"参与钩藤饮防治DD的网络药理。