伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科猪疱疹病毒Ⅰ型（Suid HepervirusⅠ，SHV-Ⅰ）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病病毒的天然宿主和贮存者，本病可引起严重的繁殖障碍，给养猪业造成较大的经济损失。及时准确地诊断，并采用安全有效的疫苗进行免疫预防，是控制该病的主要措施。为了给我国的养猪业提供安全有效的疫苗和快速、特异的可在现场进行诊断的方法，因此，开展本研究。本研究由三个互相关联的试验组成。 1．TK／gG^-疫苗的研究 测定并比较了伪狂犬病病毒鄂A亲本毒株、基因缺失突变株及Bartha株在BHK-21细胞上的增殖滴度和对Balb／C小白鼠的LD₅₀，说明对TK和gG基因的人工改造并未影响其在细胞上的生长能力；所有的TK基因突变株（包括TK^-／gG^-）对Balb／C小白鼠的毒力低于亲本毒株和Bartha株；亲本毒株、TK^-／gG^-／LacZ⁺、Bartha株对成年家兔的LD₅₀。的高低顺序依次为：鄂A野毒株、TK^-／gG^-／LacZ⁺、Bartha株：TK^-／gG^-／LacZ⁺突变株与国外目前广泛使用的NIA-783株和Begonia株的残余毒力相近。用不同滴度的TK^-／gG^-／LacZ⁺突变株接种血清学阴性妊娠母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔，无流产和产死胎、木乃伊胎，1日龄仔猪接种前后体温变化不显著（P＞0.05），也不影响增重，对猪是安全的。 将TK^-／gG^-突变株在PK-15细胞上连续传25代，每间隔5代次用PCR均能检测到已经缺失了205bp的TK基因（758bp）和插入gG基因中的LacZ基因，表明各代次毒株的遗传标志是稳定的，从分子水平证明该突变株毒力不会返强。 将不同剂量的TK^-／gG^-／LacZ⁺突变株接种抗体阴性猪，免疫猪后1个月，根据中和抗体水平和抗体阳转率的差异，确定了以10^5.0TCID₅₀,为最小免疫剂量。 应用鸡胚成纤维细胞，采用转瓶培养方式增殖而获得的疫苗病毒含量为10^6.3TCIDs₅₀／mL，为免疫剂量的13倍，将疫苗病毒与明胶保护剂混合经冻干后制成了弱毒活疫苗。疫苗的安全性测定表明，该疫苗对Balb／C小白鼠、妊娠母猪是安全的；疫苗接种15同龄仔猪，不能引起接种猪的体温升高，哨兵猪的体温没有升高，也没有抗体阳转，说明疫苗毒株的毒力已极大下降，而且缺失了TK基因后使疫苗毒株丧失了从免疫猪向非免疫猪水平传播的能力。 用该疫苗免疫抗体阴性仔猪、育肥猪和母猪，1周后可检出中和抗体；在育肥猪中抗体可持续5个月左右，抗体阴性的商品猪只需免疫1次即可。但是对于有母源抗体的仔猪，采用间隔4周加强免疫比提高免疫剂量、只免疫1次的方法可更有效地克服母源抗体的干扰。与弱毒疫苗相比，用灭活疫苗免疫的母猪可给哺乳期的仔猪提供更高水平的母源抗体，但两者的持续期均为50-70天。 免疫效力测定说明，研制的TK^-／gG^-疫苗可于接种后1周能使Balb／C小鼠耐受华中农业大学博士学位论文:猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究IOOLD50野毒的攻击;免疫后1个月，也使妊娠母猪能抵抗高达1护。TCIDS。的强毒攻击，并给仔猪提供坚强的被动免疫保护。几种不同遗传背景的疫苗给小白鼠提供的保护力高低顺序依次为Ea TK一/gG一、Begonia、NIA一783、Bartha株;刺激猪产生的抗体水平依次为N工A一783、Ea TK一/gG一、Begonia、Bartha。疫苗置一20℃、一4℃可分别保存12个月、6个月。 综上所述，以鄂A株为亲本毒株构建的TK一/gG一基因缺失疫苗具有安全性高，免疫效果优于某些国外同类产品，生产工艺成熟，完全可以进入中试阶段的研究。2.伪狂犬病毒抗体乳胶凝集试验的建立 用BHK一21细胞增殖猪伪狂犬病毒鄂A株，病毒培养上清液经硫酸钱沉淀，聚乙二醇浓缩。浓缩病毒与等量经胰酶处理的空白乳胶致敏制成凝集试验抗原。用此抗原与伪狂犬病毒标准阳性血清，免疫猪血清和临床发病猪血清以及新鲜血样样品，均呈明显的凝集反应;与标准阴性血清和临床未感染猪伪狂犬病毒猪的血清均不发生凝集反应;与猪瘟阳性血清、衣原体阳性血清、均呈阴性反应，证实本试验具有很高的特异性，抗原可在4℃条件下保存12个月;该方法比中和试验敏感、特异，整个检测过程可在1一3分钟内完成，可用于实验室和现场对伪狂犬病毒抗体的定性和定量检测。3.伪狂犬病病毒gE基因转移载体的构建 从含有伪狂犬病病毒鄂A株Sph工一A片段的重组质粒pBSA中通过酶切、克隆和亚克隆获得大小约为4.IKb含gE基因的目的片段，克隆到pBluescriPt HSK（+）载体，随后引入BamHI接头，将报告基因LacZ表达盒插入BamHI接头中获得重组子，PCR扩增和酶切鉴定证明己构建伪狂犬病病毒gE基因插入失活的转移载体，为开展TK一/gE一突变株的构建奠定基础。