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糖尿病是一种发病机制复杂的多因素疾病,与多种危险因子包括肥胖、高血压、血脂紊乱和动脉粥样硬化有关,其中胰岛素抵抗是其病理发生的重要原因。研究表明,胰岛素信号通路及GLUT4囊泡的转运障碍在胰岛素抵抗的发生发展中起了关键作用。作为脂肪细胞及骨骼肌细胞中转运葡萄糖的最主要蛋白,GLUT4能够接受胰岛素的刺激而从胞内转运至细胞膜上,但目前对于GLUT4囊泡的胞内动态转运过程及其转运相关的机制还不明确。本课题应用蛋白荧光标记技术、单细胞激光共聚焦与全内反射荧光显微成像及图像定量处理分析等生物医学研究手段,分析了大鼠原代脂肪细胞及C2C12肌细胞中GLUT4囊泡的动态转运过程,研究了胰岛素及细胞骨架对胞内GLUT4囊泡转运的影响及其作用机制,为阐明GLUT4囊泡调控的时空关系,探索糖尿病发生的细胞分子机制打下基础。本研究建立了大鼠原代脂肪细胞的培养及高效率转染的细胞模型。通过组织、细胞形态学及荧光染色的手段研究了脂肪细胞的物理及生化特性。应用电穿孔转染手段,通过摸索优化转染条件实现了原代脂肪细胞的基因高效率导入,为本课题开展的单细胞活体GLUT4囊泡成像奠定了基础。研究了大鼠原代脂肪细胞中GLUT4囊泡转运的动态过程和胰岛素及微管细胞骨架对脂肪细胞中GLUT4囊泡转运的作用及其相关生理机制。结果显示:胰岛素对于GLUT4囊泡转运的调节机制在于提高细胞膜附近单位面积内的GLUT4囊泡数目,减缓GLUT4囊泡的运动,促使更多的GLUT4囊泡与膜锚定及融合;微管蛋白的阻断剂nocodazole可以浓度依赖性的破坏脂肪细胞的微管细胞骨架,完全破坏细胞的微管结构使GLUT4囊泡的长距离运输方式消失,但并未显著减低单位面积内GLUT4囊泡的数目。表明微管细胞骨架对于GLUT4囊泡的长距离运输是必需的,而对于GLUT4囊泡在胞内的分布却是非必需的,微丝细胞骨架在GLUT4囊泡的运输中也许同样发挥作用;发现了GLUT4囊泡的长距离双向运输方式,并对此特殊运输方式进行了定量分析及合理假设。通过对大鼠原代脂肪细胞中GFP标记的IRAP蛋白的动态实时成像,研究了IRAP与GLUT4蛋白的空间定位及转运特性。研究表明:IRAP与内源性的GLUT4蛋白有充分的共定位,与GLUT4类似,外源表达的IRAP也能够响应胰岛素的刺激作用而转运至细胞膜上:在TIRFM下,大多数的IRAP都锚定于细胞膜上或聚集成团,长距离运输的方式非常少见,表明IRAP的过量表达破坏了GLUT4囊泡的运输平衡,显示IRAP可能在GLUT4囊泡转运及胞内定位中发挥作用。探讨了C2C12肌细胞中GLUT4和IRAP蛋白的胞内空间分布及胰岛素与微管细胞骨架对GLUT4囊泡转运的作用及其相关生理机制。结果表明:外源表达的IRAP与细胞中内源性的GLUT4几乎没有共定位,推测GLUT4囊泡的形成与细胞的分化状态有关;胰岛素显著提高了C2C12细胞中GLUT4和IRAP的运动性,而使用nocodazole破坏微管骨架后则显著降低了GLUT4的运动性,阐明了它们在GLUT4囊泡的转运中所发挥的生理作用。综上所述,本课题的研究取得了以下创新性成果:1)通过在大鼠原代脂肪细胞中建立稳定的基因导入体系,开展GLUT4囊泡转运调控的研究,较之使用各种已建的细胞株模型更偏机体真实的生理条件;2)以C2C12细胞为靶细胞,在肌细胞中开展GLUT4囊泡胞内运动的TIRFM成像研究,探究了胰岛素及微管骨架对GLUT4囊泡转运的调节机制;3)在两种胰岛素作用的靶细胞中,使用GFP的GLUT4和IRAP这两种标记系统来标记胞内的GLUT4囊泡,并结合活细胞实时荧光成像技术对GLUT4囊泡在胞内的异质性分布、转运特性、胞吐等相关的动态生物物理现象及胰岛素信号和微管细胞骨架对囊泡的调节等生理问题进行了系统的定量分析讨论,这些研究在国内外未见报道。