论文部分内容阅读
全球工业化的迅猛发展确实带来前所未有的经济利益，但是残留下来的某些重金属也污染了自然界中土壤、空气、海洋以及生命体，因此重金属污染也成为全世界关注的共同问题，经济有效的治理重金属污染也成为了一项迫在眉睫的任务。通过对多种重金属污染的研究发现，镉（Cd）由于其在食物链中的高移动性和高毒害性成为损害生物体的主要重金属。 植物修复技术（Phytoremediation）的分子生物学成为近年来重金属研究领域的新兴技术，而重金属超富集植物应用于植物修复方面起到了至关重要的作用。我国科学家研究指出龙葵（Solanum nigrum L.）是一种Cd超富集植物，其随着长期进化发展而拥有自身的防御系统，是植物修复技术的良好材料。然而龙葵对Cd的富集能力是有限的，随着处理时间的延长以及重金属浓度的提高，植物自身受损，生物量下降而起不到植物修复的目的。经研究，激素类物质对于抵抗非生物胁迫起到一定的调节作用，油菜素内酯（Brassinosteroids，BRs）是近来发现的第六大植物激素，对植物的生长发育、繁殖，以及应对非生物胁迫上均有一定的作用。 本论文以Cd超富集植物龙葵为实验材料，通过检测Cd胁迫下龙葵的生物量，叶绿素含量，MDA含量及抗氧化酶活性，筛选出外源2,4-表油菜素内酯（EBL）对龙葵Cd胁迫耐受性提高作用的适宜浓度。在此基础上，对Cd胁迫下的龙葵材料进行EBL处理，检测其叶片和根部重金属胁迫相关基因的表达变化，并针对实验结果，对其中的泛素连接酶SorRma1基因进行编码区全长的克隆以及生物信息学分析，以期为研究油菜素内酯是否存在增强龙葵对Cd胁迫耐受性的作用以及哪些胁迫相关基因参与其中提供一定的理论依据。主要实验结果包括以下几个方面： 1、龙葵在Cd胁迫7 d、20 d后，对外源低浓度10-9、高浓度10-5 mol?L-1 EBL各处理组进行根长、株高、鲜重、干重等生物量以及生理指标测定。与单一Cd处理相比，Cd胁迫20 d，外源低浓度10-9 mol?L-1 EBL处理条件下，龙葵的生物量相对较高且叶片和根部MDA含量显著下降，抗氧化酶活性显著上升，说明Cd胁迫20 d后，外源10-9 mol?L-1 EBL处理可以增强龙葵对Cd胁迫的耐受能力。 2、Cd胁迫下，外源EBL处理（CK、单一EBL、单一Cd、Cd+EBL处理3、7、12 h处理组）后测定龙葵叶片和根部生理指标发现叶绿素含量没有显著变化；Cd胁迫下，叶片和根部MDA含量、POD、SOD和CAT活性显著升高；与单一Cd处理相比，外源EBL处理3 h后MDA含量显著降低，POD、SOD、和CAT活性显著升高，外源EBL处理12 h后POD、SOD活性又下降，但抗氧化酶活性均高于单一Cd胁迫处理组。说明外源EBL处理通过降低龙葵体内MDA含量，增强抗氧化酶活性来减轻膜脂损伤，增强清除活性氧的能力继而提高龙葵对Cd胁迫的耐受能力。 3、Cd胁迫下，外源EBL处理（CK、单一EBL、单一Cd、Cd+EBL处理1 h、3h、5h、7h、12h处理组）后，对三类基因在龙葵叶片和根部的表达进行半定量RT-PCR检测，基因包括：泛素酶基因SorRma1、UBC；EBL信号转导基因TCH4、BRU1；CDF家族基因MTP1。为了验证条带的专一性，又进行片段基因克隆，测序得出片段序列信息，进行下一步荧光定量PCR检测。 4、Cd胁迫下，外源EBL处理（CK、单一EBL、单一Cd、Cd+EBL处理1 h、3 h、5 h、7 h、12 h处理组）后，对三类基因（泛素酶基因SorRma1、UBC；EBL信号转导基因TCH4、BRU1；CDF家族基因MTP1）在龙葵叶片和根部的表达进行荧光定量PCR检测。与单一Cd胁迫相比，外源EBL+Cd处理组不同基因表达量在各自时间点上均有显著升高，随着外源EBL处理时间的延长，各基因表达量均有下降趋势。在外源EBL处理后的龙葵叶片和根部，SorRma1基因在3 h时达到最大表达量，UBC基因分别在5 h和1 h达到最大值，BRU1基因均在3 h达到最大值，TCH4基因分别在7 h、1 h达到最大值，MTP1基因分别在7 h、5 h达到最大值。与单一Cd胁迫处理组相比，外源EBL后叶片SorRma1、BRU1基因表达量均在处理3 h后首先达到最大值，根部UBC、TCH基因表达量均在1 h后首先达到最大值。说明叶片SorRma1、BRU1基因，根部UBC、TCH基因响应EBL更迅速，外源EBL在诱导增强耐受胁迫相关基因表达量上存在组织差异性。 5、利用同源克隆方法对E3泛素蛋白连接酶基因SorRma1进行克隆以及生物信息学分析，得到1个SorRma1基因的cDNA全长序列，登录到GenBank，号码是:XM_015227365.1。该基因cDNA全长708 bp，且SorRma1蛋白由236个氨基酸构成，相对分子质量为26.21 KD，理论PI值为8.21。对龙葵SorRma1蛋白进行二级结构预测，结果表明该蛋白质二级结构主要由α螺旋（24.58％）、β折叠（24.58%）、无规则卷曲（47.3%）构成，此外还有少量的β转角（3.81%）。对龙葵SorRma1基因进行同源性分析，发现该基因氨基酸序列与马铃薯、番茄（Solanum lycopersicum，XM_010325436）、番茄（Solanum lycopersicum，AK324673）及野生种潘那利番茄互为并系，但支持率仅为66%。