朊病毒是一种可感染人和动物中枢神经系统的传染性蛋白质,其引起的疾病包括人的克雅氏病、库鲁病、吉斯曼综合征、致死性家族失眠症以及动物的羊瘙痒症、疯牛病等,死亡率达100%。目前普遍认为其致病原因是具有正常生理结构的朊蛋白PrPc在未知因素诱导下发生异常折叠转变为具蛋白酶抗性的致病朊蛋白PrPSc。在朊病毒感染的早期阶段,异常折叠的PrPsc蛋白可激发多种应激反应引起神经元的损伤,同时被感染的神经元试图通过自噬或凋亡的方式以达到清除PrPsc的目的；在感染的晚期阶段,由于大量的PrpSc蛋白无法被及时清除,引起的神经毒性造成了一系列的病理学改变,如神经元的死亡、星型胶质和小胶质细胞的增生、淀粉样斑块沉积和脑组织内空泡样变性等。尽管目前对朊病毒引起神经元死亡的机制已有一定了解,但其详细的机制尚未阐明。长期以来的研究认为成熟的神经元属于终末分化的细胞,处于不可分裂的状态,无法越过Go期而进入细胞周期。然而近年来的研究表明在阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease, AD)和帕金森症(Parkinson’s disease, PD)等中枢神经系统退行性疾病患者的脑组织切片中检测到神经元中上调表达的细胞周期蛋白,因此科学家们提出了中枢神经元可在某种因素的诱导下重新进入细胞周期的假说,并在AD、PD和朊病毒病的细胞模型中证实了这一假说。Polo样激酶(Polo-like kinases, PLKs)是广泛存在于真核生物中的一类丝氨酸/苏氨酸激酶,对细胞周期的各个关键点发挥多种精密的调控作用,如中心体的复制、成熟、有丝分裂的进入和姐妹染色体的分离等。目前已在哺乳动物中发现五种PLK,其中PLK1的上调和PLK3的下调表达与多种恶性肿瘤的发展及不良预后相关。除了在细胞周期中发挥作用之外,PLK2/3还参与中枢神经系统突触可塑性的调节。由于朊病毒病中存在神经元细胞周期再进入事件,而PLK1/3在细胞周期G2/M期转化过程中发挥关键的调节作用,我们前期的基因芯片转录谱分析发现在朊病毒病患者脑组织中PLK1上调,而PLK3下调,因此我们建立这样的假说：“朊病毒病中PLKs参与调控神经元细胞周期阻滞”。本研究利用朊病毒感染的细胞模型和动物模型,通过免疫组织化学、免疫印迹等技术探讨了PLKs在朊病毒病病程中的变化规律,分析了其在神经元细胞周期阻滞和清除PrPSc蛋白中的重要作用和机制,为临床精准治疗朊病毒病提供实验室研究基础。本研究主要分两大部分：第一部分：朊病毒病中PLK1/3信号介导神经元细胞周期阻滞为了观察朊病毒病中PLK是否参与神经元细胞周期再进入的调控,我们首先采用蛋白免疫印迹、免疫组化、免疫荧光等方法,检测了朊病毒羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中PLK等细胞周期相关蛋白的组织分布和表达水平的变化,结果发现：与正常脑组织相比,感染263K脑组织的皮质和小脑区域PLK1和PLK3的染色变化显著,在感染终末期的脑组织匀浆中PLK1的表达明显升高,而PLK3的表达明显降低,甚至消失。动态研究发现在仓鼠朊病毒病的潜伏期PLK1/3的表达即发生了变化。激光共聚焦分析显示PLK1/3与皮层灰质区的神经元标志物Neun存在明显的共定位,而与胶质细胞的标志物GFAP不发生共定位,这提示PLK1/3主要分布在神经元中,明确了PLK1/3的表达变化发生在神经细胞中。进一步检测发现PLK1的下游蛋白Cyclin B1的表达也明显上调,而PLK3的下游蛋白Cdc25C和p-Cdc25C (ser-216)却表达下调,这些变化可促使神经元再次进入细胞周期,并由G2期向M期转化,然而M期蛋白p-Histone H3的表达却无明显变化,这一结果说明了朊病毒病中PLK3调控神经元再次进入细胞周期,但并不能完成整个细胞周期,从而引起细胞周期阻滞引发神经元凋亡,最终导致神经元的丢失。在稳定感染朊病毒的SMB-S15细胞系中我们观察到类似于朊病毒病仓鼠模型中PLK1/3的变化。为了排除细胞系永生化状态对研究细胞周期的影响,接着我们又采用PrPsc类似肽106-126处理了小鼠原代皮质神经细胞,结果与上述研究相一致。第二部分：PLK3介导对异常朊蛋白的降解作用为进一步阐明PLK3表达下调与朊病毒病的关系,我们通过GST pull-down和免疫共沉淀的方法,在体内和体外证实了PLK3和PrP蛋白的相互作用关系,不仅全长的PLK3可以与PrP蛋白发生相互作用,PLK3蛋白N端的激酶区(kinase domain, KD)和C端的Polo盒子区(Polo-box domain, PBD)都能与PrPsc蛋白发生相互作用。为了更深入地解析PLK3与PrP蛋白之间发生相互作用的生物学意义,我们将不同浓度的PLK3蛋白和野生型及突变体PrP蛋白的质粒转染至HEK293细胞中,结果发现高浓度的PLK3可以降解突变体PrP蛋白,但对野生型PrP蛋白的表达影响不大。PLK3的这种降解作用似乎依赖于PLK3蛋白的KD区,而与PBD区无关。进一步利用RNAi技术敲低PLK3的表达可以明显增加异常PrP突变体蛋白的水平。利用蛋白酶体和自噬溶酶体抑制剂处理后发现,蛋白酶体抑制剂和巨自噬抑制剂对PLK3介导的PrP突变体的降解作用无明显影响,而溶酶体途径抑制剂能明显阻断PLK3对PrP突变体的降解作用,提示该降解作用依赖于溶酶体途径。我们在稳定感染朊病毒的SMB-S 15细胞系中也发现了类似的现象,即转染PLK3质粒后,上调PLK3的表达可以显著降低异常PrPSc蛋白的水平,而对正常Prpc蛋白的表达水平影响不大。综上所述,我们的实验结果表明,终末分化的中枢神经细胞在受到朊病毒病感染因子的刺激下,迅速驱使细胞再次进入细胞周期以应对感染引起的应激压力,但神经细胞由于缺乏完成有丝分裂的相关调控元件,导致细胞周期被阻滞在M期,致使细胞周期再启动的失败,我们推测这种异常的细胞周期再进入事件启动了凋亡程序,最终导致了神经细胞的死亡。同时我们发现PLK3蛋白可通过其N端的KD区介导对朊病毒蛋白的降解。因此,如果在朊病毒感染的早期通过某种干预手段诱导PLK3的表达,有可能防止异常PrPSc蛋白的聚集并阻止细胞周期的再进入,我们的实验研究结果为朊病毒病的精准靶点治疗提供新的线索和思路,同时也为其它神经退行性疾病的治疗提供借鉴。