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前言支气管哮喘是一种免疫源性炎症气道疾病,以气道平滑肌痉挛及渐进性气道高反应为主要特点,其发病机制尚不完全清楚。近年来,神经源性炎症越来越受到关注,但对于神经系统与这些炎症过程复杂的相互作用了解甚少。最近研究表明神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是一个重要介质。哮喘患者血清NGF水平增高,支气管哮喘动物模型的研究结果显示NGF能引起气道高反应,外源性NGF可引起豚鼠对组胺的气道高反应增加,应用NGF抗体可大大减少哮喘引起的气道高反应。近年来,本室的研究结果证实:NGF在哮喘豚鼠下呼吸道、肺内炎性细胞和感觉神经节等内脏感觉传入部位过表达。PBK/Akt既是P13K的一个重要的下游调节激酶,在糖代谢、蛋白质合成、细胞抗凋亡过程中均起着重要的作用,但它又可不依赖于P13K途径而被NGF激活,NGF激活TrkA使其与SH2-Bβ结合,促使SH2-Bβ发生洛氨酸磷酸化,SH2-Bβ再作用于Akt/PKB,Akt/PKB进一步激活分插头转录因子,促使PC12细胞分化增殖。最近本室有研究提示,Akt/PKB很可能参与了哮喘发病机制中NGF介导的信号传导通路但它如何参与哮喘调节的机制尚不十分清楚。有研究显示,哮喘发作期和缓解期患者血清IL-1β水平明显高于对照组;鼠哮喘模型肺组织及C7-T5节段脊神经和相应节段脊髓后角IL-1βmRNA和肺泡灌洗液中IL-1β水平均明显升高。前炎症因子IL-1β可上调气道上皮细胞TGF-β1mRNA表达,从而对气道上皮的损伤进行修复,当过度调节后可导致气道重塑。白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)能明显减少肺部嗜酸性粒细胞浸润,降血清、肺泡灌洗液中ECP水平及血清中IL-5的含量,促进嗜酸性细胞凋亡。这都提示着IL-1β在哮喘发病中有着重要作用,但是IL-1β是否参与了Akt/PKB调节的哮喘发病机制,是一个值得探讨的问题。血管内皮生长因子(VEGF)属于血小板源生长因子家族,是由两个相同多肽链通过二硫键形成的同源二聚体糖蛋白。多种细胞可分泌VEGF,特异性作用于内皮细胞,调节内皮细胞有丝分裂,增加血管通透性和血管紧张性,还可促进胚胎期血管形成。有研究显示,哮喘模型大鼠肺组织中VEGF及其受体Flk-1表达上调,并与气道平滑肌增殖有密切关系,该结果提示VEGF及其受体可能参与了哮喘气道重建中气道平滑肌增殖的过程。王修珍等也证明了白三烯受体拮抗剂可以降低哮喘豚鼠肺组织VEGF表达水平,从而减少血管增生,延缓哮喘气道重塑的发生。还有实验提示地塞米松可能通过降低VEGF,纠正血管生成促进因子/抑制因子比例失衡部分地抑制气道血管生成,延缓气道重塑,这都提示着VEGF在哮喘发病中有着重要作用,Akt/PKB作为维持细胞存活的一个重要蛋白,极有可能参与了新血管的形成过程,但目前还没有相关文献报道,本研究旨在探讨在哮喘中Akt/PKB与VEGF的关系。本文利用免疫组织化学和Western blot方法,观察在PKB/Akt被阻断后,哮喘小鼠肺组织内VEGF、IL-1β以及内脏感觉传入部位IL-1β表达的影响,探讨PKB/Akt蛋白是否通过调节炎性因子IL-1β以及血管内皮生长因子VDGF参与哮喘发病机制的调节。通过这些问题的解决,我们将进一步清楚哮喘发病的信号转导机制,为寻找新的治疗方法提供理论依据。材料和方法一、实验材料1、实验动物本研究采用雌性BALB/c小鼠30只,由首都医科大学实验动物中心提供,均为雌性,体重在18～25g。2、主要试剂兔抗小鼠IL-1β抗体,兔抗小鼠VEGF抗体均购于武汉博士德试剂公司;辣根过氧化物酶结合羊抗兔免疫球蛋白和SABC法免疫组化试剂盒均购于武汉博士德试剂公司;β-actin,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二次抗体,FITC标记的山羊抗兔二次抗体均购于北京中山公司;3、主要仪器AniRes动物肺功能分析系统;RES1030信号调理器;电热恒温干燥箱;电子分析天平;恒温水浴箱;低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;正置荧光显微镜;-80度深低温冰箱;恒温冰冻切片机;MoticImages Advanced3.2图象分析系统;二、实验方法1、制备哮喘模型.腹腔注射卵蛋白致敏BABL/C小鼠,雾化吸入卵蛋白激发致喘。2、免疫组织化学检测各组小鼠肺组织VEGF和IL-1β的表达,检测C7-T5节段脊神经和相应节段脊髓后角IL-1β的表达。3、Western blot方法检测各组小鼠肺组织VEGF和IL-1β的表达,检测C7-T5节段脊神经IL-1β的表达。4、图象分析Western blot结果用Chemi Imager5500V2.03软件扫描,用Fluor Chen2.0软件定量分析显色带的IDV值。免疫组化结果用Motic Images Advanced 3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。5、统计学处理所有数值均以均数±标准差表示,实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较进行,检验。实验结果一、IL-1β免疫组织化学结果显示:哮喘组肺、C7-T5段脊神经节和相应节段脊髓后角IL-1β阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于生理盐水组(P＜0.01);而PKB/Akt阻断组与哮喘组相比,肺组织及C7-T5节段脊神经和相应节段脊髓后角内IL-1β阳性反应产物的平均光密度值明显降低(P＜0.05)。Western blot结果显示:与生理盐水组比较,哮喘组小鼠肺、C7～T5段脊神经中IL-1β目标带的IDV(integrated density value)与内参照IDV的比值均明显升高(p＜0.01),而PKB/Akt阻断组上述部位样品中IL-1β目标带的IDV与内参照IDV的比值均明显低于哮喘组(P＜0.05).二、VEGF免疫荧光结果显示:哮喘组肺组织内VEGF阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于正常对照组(P＜0.01);而PKB/Akt阻断组与哮喘组相比,上述部位VEGF阳性反应产物的MOD值明显降低(P＜0.05)。Western blot结果显示:与正常对照组比较,哮喘组小鼠肺组织内VEGF的IDV(inte grated density value)与内参照IDV的比值均明显升高(P＜0.01),而PKB/Akt阻断组上述部位样品中IL-1β目标带的IDV与内参照IDV的比值均明显低于哮喘组(P＜0.05).讨论IL-1曾称为淋巴细胞活化因子,在哮喘发病中起着重要作用。有研究显示,哮喘发作期和缓解期患者血清IL-1β水平明显高于对照组;前炎症因子IL-1β可上调气道上皮细胞TGF-β1 mRNA表达,从而对气道上皮的损伤进行修复,当过度调节后可导致气道重塑。白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)能明显减少肺部嗜酸性粒细胞浸润,降血清、肺泡灌洗液中ECP水平及血清中IL-5的含量,促进嗜酸性细胞凋亡。这都提示着IL-1β在哮喘发病中有着重要作用.在本实验的研究中发现,哮喘组肺、C7-T5段脊神经节和相应节段脊髓后角IL-1β阳性产物显著高于正常对照组;而PKB/Akt阻断组与哮喘组相比,上述部位IL-1β阳性反应产物明显降低,提示Akt很可能通过调节IL-1β的表达来参与哮喘发病机制的调解。多种细胞可分泌VEGF,特异性作用于内皮细胞,调节内皮细胞有丝分裂,增加血管通透性和血管紧张性,还可促进胚胎期血管形成。有研究显示,哮喘模型大鼠肺组织中VEGF及其受体Flk-1表达上调,并与气道平滑肌增殖有密切关系,该结果提示VEGF及其受体2可能参与了哮喘气道重建中气道平滑肌增殖的过程。王修珍等也证明了白三烯受体拮抗剂可以降低哮喘豚鼠肺组织VEGF表达水平,从而减少血管增生,延缓哮喘气道重塑的发生。这都提示着VEGF在哮喘发病中有着重要作用。本实验研究证明,哮喘组肺组织内VEGF阳性产物显著高于正常对照组;而PKB/Akt阻断组与哮喘组相比,上述部位VEGF阳性反应产物明显降低,提示Akt很可能通过调节VEGF的表达来参与哮喘发病机制的调解。本研究进一步明确了哮喘发病的信号转导机制,为寻找新的治疗方法提供理论依据。结论1、Akt能上调哮喘小鼠肺组织内VEGF的表达,提示Akt可能通过调节VEGF的表达参与NGF介导的哮喘发病机制过程。2、Akt能上调哮喘小鼠肺内、C7-T5脊神经节及相应脊髓后角神经元IL-1β的表达,提示Akt可能通过调节IL-1β的表达参与NGF介导的哮喘发病机制过程。