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在鱼类的早期胚胎发育中生殖细胞便与体细胞分离,形成所谓的原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)。随着胚胎的发育,原始生殖细胞经起源、迁移,最终到达正在发育的性腺原基(或原始生殖嵴),之后经配子发生进一步发育形成精原细胞或卵原细胞等生殖细胞,最终发育为精子或卵子。生殖细胞具有独特的基因表达模式,一些基因特异地在生殖细胞中表达,如vasa、dead end(dnd)、nanos3、dazl、piwi等母源性基因。自从斑马鱼(Danio rerio)vasa基因成功地应用于原始生殖细胞的标记,越来越多的研究者开始利用这些生殖系特异表达基因作为标记来研究生殖细胞的发生发育。nanos基因最初被发现在果蝇(Drosophila melanogaster)的胚胎发育中能够抑制hunchback mRNA的翻译,参与前后体轴的建立,后来发现它还参与原始生殖细胞的迁移和维持,对生殖干细胞的自我更新有重要作用。母源性基因Dead end(dnd)在胚胎发育中特异地表达于原始生殖细胞,编码一种进化上保守的RNA结合蛋白,对生殖细胞发育具有重要作用。本研究通过SMART-RACE等技术克隆鉴定了大黄鱼(Larimichthys crocea)nanos基因3种亚型和dnd基因,分别命名为Lcnanos1、Lcnanos2、Lcnanos3和Lcdnd。实时定量PCR研究大黄鱼nanos、dnd基因在大黄鱼各组织中的表达。整胚原位杂交技术研究其在胚胎发育中的时空表达。通过nanos3与dnd在胚胎发育中的表达模式分析大黄鱼原始生殖细胞的起源与迁移。结果如下:1.Lcnanos1 cDNA全长1296 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KF690631.1;Lcnanos2 cDNA全长948 bp,编码175个氨基酸,登录号为KJ144823.1;Lcnanos3cDNA全长1519 bp,编码223个氨基酸,登录号为KF920597.1。在各亚型nanos推测的氨基酸序列中有两个连续的Cys-Cys-His-Cys特异锌指结构域,这一结构域在各物种间均非常保守。Lcdnd序列长1359 bp,编码380个氨基酸。推测的Lcdnd氨基酸序列中包含两段RNA结合蛋白保守的RNA识别基序或称为RNA结合结构域,对于脊椎动物的生殖细胞的维持有重要作用。2.实时定量PCR的组织表达分析显示,Lcnanos1在精巢中高表达(P<0.05),而心脏、脑、眼和卵巢等其它各组织中表达量较低;Lcnanos2与Lcnanos3在性腺中特异表达,且它们分别在精巢和卵巢中高表达(P<0.05)。Lcnanos在各组织中的表达差异暗示它们在功能上的差异。与Lcnanos3类似,Lcdnd在卵巢中的表达量显著高于其它各组织(P<0.05),精巢中表达量相对较低,其它组织未见表达。3.整胚原位杂交技术分析了Lcnanos与Lcdnd在胚胎发育过程中的时空表达。Lcnanos1和Lcnanos2从卵裂阶段到孵出期都未见阳性信号(未在文中显示),而Lcnanos3与Lcdnd在胚胎发育阶段都有表达,且表达模式相同,这为揭示大黄鱼原始生殖细胞的起源与迁移提供一定的参考。整胚原位杂交结果显示:Lcnanos3/Lcdnd在早期卵裂阶段主要分布于分裂沟,发育至囊胚期至原肠早期这一阶段阳性信号定位在胚盘边缘(胚环)的细胞内,且阳性信号增多,阳性信号细胞大小约10μm,暗示原始生殖细胞的形成,在原肠早期时定位于胚环中的中内胚层。接着原始生殖细胞沿胚环向胚体形成处(胚盾)迁移;随着胚胎的发育,发现胚体两侧的阳性信号增多;到体节发生期,阳性信号细胞分布于胚体两侧的侧板中胚层,细胞直径10-11μm;随着体节的发生这些细胞沿背腹轴向腹部运动;发育到孵出期时,到达了发育中的原始生殖嵴。综上所述,Lcnanos3与Lcdnd mRNA为母源性生殖质成分,在生殖细胞中特异表达,其表达模式揭示了大黄鱼原始生殖细胞在囊胚期开始形成,起源模式为先成论模式。通过其表达模式,初步分析了大黄鱼原始生殖细胞的迁移路径。本研究为鱼类生殖细胞早期的发生发育及育性控制等研究提供了基础资料。