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目的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S. pn）主要定植于人类上呼吸道，能引起脑膜炎、中耳炎、肺炎、败血症等一系列严重的疾病，在全世界范围内有较高的发病率和病死率，尤其是对5岁以下的儿童和老人。随着肺炎链球菌多种抗生素耐药菌株的不断出现，通过疫苗预防的方式来抵抗肺炎链球菌引起的感染性疾病显得越来越重要，但是目前上市的肺炎链球菌疫苗存在较多缺陷。因此，新型肺炎链球菌疫苗是近年该领域的研究热点。蛋白质疫苗具有免疫原性强、非血清型依赖、生产工艺简单等特点，是一类非常有发展潜力的新型疫苗。肺炎链球菌DnaJ蛋白是热休克蛋白40（Hsp40）家族的成员之一，通过腹腔或粘膜免疫重组DnaJ蛋白后，Balb/C小鼠可抵御不同血清型肺炎链球菌致死剂量的鼻腔感染。Pneumolysin（Ply）是肺炎链球菌保守表达的一个53KDa的表面溶血活性蛋白，减毒的Ply蛋白（A146Ply）是一种比较有效的疫苗候选蛋白，经粘膜免疫实验动物可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著的保护作用。同时也有报道提示Ply具有潜在的粘膜佐剂的功能，Ply与目的蛋白融合表达后通过粘膜途径免疫可以诱导宿主产生较高水平的特异性IgG和IgA。因此，本研究旨在评价A146Ply的佐剂效应，探讨粘膜免疫DnaJ-A146Ply融合蛋白对肺炎链球菌的保护效果及其机制，评估其作为疫苗候选蛋白的可行性。方法通过原核表达方式利用大肠杆菌表达肺炎链球菌DnaJ蛋白（全长）、减毒Ply蛋白（A146Ply）、DnaJ-A146Ply及A146Ply-DnaJ融合蛋白，分别进行亲和纯化后，进一步去除蛋白中混有的脂多糖，然后皮下免疫C57BL/6小鼠制备相应的特异性多克隆抗血清。利用前期实验所制备的anti-DnaJ及anti-A146Ply多克隆抗血清，经Westernblot对两种融合蛋白的抗原表位进行分析验证；同时利用抗融合蛋白DnaJ-A146Ply和A146Ply-DnaJ抗血清，分析其对不同血清型肺炎链球菌中的DnaJ及Ply的识别。分别将纯化的重组DnaJ-A146Ply及A146Ply-DnaJ融合蛋白及单一蛋白对照组经鼻腔粘膜免疫C57BL/6小鼠，ELISA法检测免疫后小鼠血清及唾液中特异性抗体效价及亚型，以及脾细胞经刺激后细胞因子(IL-4, IFN-γ, IL-10和IL-17A)的分泌水平，HE染色观察肺组织的炎症情况，同时采用ELISA法检测血清中总IgE水平。分别以肺炎链球菌CMCC31207（6B型）及CMCC31693（19F型）进行鼻腔攻毒，于攻毒第4天取小鼠鼻腔灌洗液及肺组织匀浆，铺板计数细菌载量，评价融合蛋白疫苗对肺炎链球菌定植的保护效应；以肺炎链球菌D39（2型）及CMCC31436（3型）分别进行鼻腔攻毒，监测小鼠生存率，评价融合蛋白疫苗对肺炎链球菌致死性感染的保护效应。为进一步探索IL-17A在疫苗发挥免疫保护效应中的作用，将重组DnaJ-A146Ply分别粘膜免疫野生型C57BL/6小鼠（WT）及IL-17A缺陷型C57BL/6小鼠（IL-17AKO），比较二者血清及唾液中特异性抗体效价及细菌定植数量的差异。结果成功构建pET-28(a)-DnaJ-A146Ply及pET-28(a)-A146Ply-DnaJ重组质粒，经表达纯化后获得纯度＞90%的重组融合蛋白，且其内毒素含量均不高于0.1EU/μg；Western blot结果显示：DnaJ-A146Ply及A146Ply-DnaJ融合蛋白均可以被anti-DnaJ及anti-A146Ply多克隆抗血清识别，同时抗DnaJ-A146Ply和A146Ply-DnaJ的抗血清不仅可以特异性的识别重组DnaJ及A146Ply，也可以识别不同血清型肺炎链球菌中的天然DnaJ及Ply蛋白。与单独的DnaJ免疫组相比，DnaJ-A146Ply融合蛋白粘膜免疫小鼠能在血清及唾液中产生更高滴度的特异性IgG及IgA（P＜0.01），且血清中特异性IgG升高的时间提前，其血清中的IgG以IgG1、IgG2a及IgG2b为主；肺炎链球菌鼻腔攻毒结果显示，与单独免疫DnaJ蛋白相比，免疫DnaJ-A146Ply融合蛋白能显著减少6B及19F型肺炎链球菌在小鼠鼻咽部（P＜0.05）和肺部（P＜0.001）的定植，并能提高2型（P＜0.001）和3型（P＜0.001）肺炎链球菌攻毒后小鼠的生存时间，其保护效果与市售多糖疫苗PPV23效果相当。同时，免疫后小鼠肺组织切片HE染色结果提示：免疫DnaJ-A146Ply融合蛋白组小鼠肺组织炎症反应弱于含有CT佐剂的免疫组，且血清总IgE水平也显著低于CT佐剂免疫组。粘膜免疫DnaJ-A146Ply融合蛋白可以有效刺激小鼠脾细胞产生高水平的IL-17A（P＜0.05）。与野生小鼠相比，IL-17A缺陷小鼠在粘膜免疫DnaJ-A146Ply融合蛋白后，不能刺激小鼠唾液中产生高滴度的IgA（P＜0.05），且不能降低19F型肺炎链球菌在小鼠鼻咽部（P＜0.001）和肺部（P＜0.001）的定植。结论本研究首次证明了A146Ply具有粘膜佐剂的功能，与DnaJ融合表达后通过粘膜免疫可以诱导C57BL/6小鼠产生较高水平的特异性IgG和sIgA，与CT佐剂相比，该蛋白佐剂较为安全。DnaJ-A146Ply融合蛋白鼻腔免疫后可有效帮助小鼠抵抗肺炎链球菌在鼻咽部、肺部的定植和致死性感染，保护效果与市售PPV23相当，且保护效果具有非血清型依赖性。粘膜免疫DnaJ-A146Ply融合蛋白可激发Th17型免疫反应产生较高水平的IL-17A，在诱导产生粘膜特异性sIgA及清除肺炎链球菌定植的保护作用中发挥重要作用。综上所述，我们认为DnaJ-A146Ply融合蛋白是一种较好的肺炎链球菌疫苗候选蛋白，其主要通过IL-17A发挥其免疫保护作用。