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研究背景结核病(tuberculosis)是一种严重危害全球的重大传染性疾病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)感染引起。结核病的病死率在传染性疾病中居于第二位,仅次于人免疫缺陷病毒感染(human immunodeficiency virus,HIV)的致死率。我国是结核病高发国家之一,其发病率和死亡率长期据我国甲、乙类传染病前列,占全球总结核病病例数的11%。结核病难于控制的主要原因是缺乏有效的结核病疫苗。另外,结核分枝杆菌可以在人体巨噬细胞内以潜伏状态存在,借此逃避机体免疫系统和药物对其的杀伤作用。卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)是目前临床应用广泛的预防结核病的疫苗,但是接种BCG预防结核病的保护效应不确定。BCG接种可以预防儿童患严重的粟粒性结核及脑膜炎结核,但是BCG的保护性免疫反应随着年龄的增加逐渐减弱,对成人肺结核缺乏有效的免疫保护。目前,处于研究阶段的新型结核分枝杆菌疫苗包括活菌疫苗和亚单位疫苗。人们普遍的观点认为,亚单位疫苗可以用于加强BCG免疫所引起的免疫应答,进而延长并维持BCG的保护效果。我们前期共构建并评价了 6个融合蛋白亚单位疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4(EAMM),Mtb10.4-HspX(MH),ESAT6-Mtb8.4,Mtb10.4-Ag85B,ESAT6-Ag85B和ESAT6-RpfE,发现EAMM保护效果最好。此外,EAMM(仅由结核分枝杆菌复制期抗原组成)和MH(由结核分枝杆菌复制期和潜伏期抗原组成)联合应用时,其保护效果比单独应用时更好。研究目的为了建立对不同生长状态结核分枝杆菌的免疫力,本研究选择具有免疫优势的结核分枝杆菌复制期抗原和休眠期抗原,构建融合了结核分枝杆菌多阶段抗原的亚单位疫苗。此外,探索抗原剂量和免疫调节剂雷帕霉素对亚单位疫苗所诱导的免疫记忆的作用,以研究影响亚单位疫苗长期保护效率的因素。研究方法在本研究中,我们结合结核分枝杆菌复制期抗原ESAT6,Ag85B,MPT64,Mtb8.4 和潜伏期抗原 HspX,构建融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MPT64(190-198)-Mtb8.4-HspX(EAMMH),因分子量为69kD,简称为LT69。融合蛋白构建成功之后,我们用大肠埃希菌BL21对其进行表达,并利用盐析和层析技术相结合的方法将其分离纯化。融合蛋白LT69和佐剂阳离子脂质体二甲基三十六烷基钱(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidyli cacid,PolyI:C)混合,构建结核亚单位疫苗。然后,我们将LT69疫苗免疫小鼠,检测该疫苗在小鼠体内诱导的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答;疫苗末次免疫30周后,将疫苗免疫的小鼠用结核分枝杆菌H37Rv株经呼吸道感染,评价该疫苗在小鼠体内抗结核的保护效果。此外,将不同剂量(50μg、10 μg和2μg)的LT69疫苗免疫小鼠,检测不同剂量的疫苗所诱导的免疫记忆的差异,并评价不同剂量疫苗免疫所产生的长期保护效果。同时,我们将LT69疫苗和雷帕霉素联合免疫小鼠,评价雷帕霉素对LT69疫苗所诱导的记忆性T细胞的影响,及其对疫苗长期保护效果的影响。研究结果成功构建了融合蛋白LT69。LT69在大肠埃希菌BL21中高效表达,应用硫酸铵盐析和层析相结合的方法成功将其分离纯化。LT69疫苗在小鼠体内诱导产生高水平的抗原特异性IFN-,γ、IL-2和抗体IgG1、IgG2c。结核分枝杆菌H37Rv(50-100 CFU)经呼吸道气雾攻击小鼠后,LT69疫苗(10μg)免疫组小鼠肺脏的结核菌载量(5.85±0.39 Log10 CFU)和BCG免疫组(6.01 ±0.33 Log10 CFU)相当,低剂量LT69免疫组小鼠肺脏的结核菌载量(5.38±0.35 Log10 CFU)低于BCG组。抗原剂量研究表明,低剂量LT69(2μg)疫苗接种小鼠产生的IFN-y的分泌水平在疫苗末次免疫6周和高剂量组没有明显差异,但在疫苗末次免疫24周要明显高于高剂量(10μg和50μg)组,说明低剂量疫苗诱导了较长期的细胞免疫记忆。在疫苗末次免疫30周后进行的攻毒试验表明,低剂量LT69免疫组小鼠肺脏的结核菌载量低于高剂量组和BCG组,和免疫检测结果一致。雷帕霉素和疫苗LT69联合免疫,24周后进行体外脾脏淋巴细胞功能检测。特异性抗原刺激后,雷帕霉素联合免疫小鼠脾细胞所产生的IFN-γ分泌水平明显高于疫苗单独免疫组。经尾静脉用5 106CFU的BCG攻击小鼠,雷帕霉素联合免疫小鼠体内的细菌载量低于疫苗单独免疫组0.8-log10 CFU。结论结核分枝杆菌亚单位疫苗LT69同时融合了结核分枝杆菌复制期抗原和休眠期抗原,免疫机体后可以清除不同代谢状态的结核分枝杆菌。LT69在小鼠体内具有较强的免疫原性,其保护效果达到和BCG相当的水平。低剂量的疫苗比高剂量的疫苗诱导产生更长久的免疫记忆,长期保护效果也更强。雷帕霉素处理可以促进LT69疫苗诱导产生更多长期记忆性T细胞,从而提高疫苗的长期保护效果。研究背景持留菌(persister)是在效果非常强的抗生素(lethal antibiotics)或者压力(stresses)的作用下能够继续存活的一小群静止期的细菌,这群细菌在适当的条件下可以继续增殖。持留菌的存在造成感染患者体内细菌的潜伏和治疗后的反复发作,使细菌感染性疾病的治愈面临挑战。目前所使用的抗生素中,除了治疗结核病的药物吡嗪酰胺(PZA)具有一定的抗持留菌的作用外,其他大部分的药物只针对复制期代谢比较活跃的细菌起作用。探索针对持留菌有效的药物,是治疗细菌感染性疾病的有效措施和手段。目前所使用的抗生素对持留菌没有治疗效果的主要原因是,在筛选抗菌的药物时人们通常使用的是代谢活跃的复制期的细菌,而没有考虑用持留菌模型进行药物筛选。研究目的本研究试图建立包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusawrews,S.awreius)、大肠埃希菌(Escherichia co/i,E.coli)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M/wberculosis)在内的持留菌体外模型,从一些临床应用的化合物中筛选抗细菌持留菌的有效药物,为临床细菌持续感染性疾病的治疗提供一些新的指导。研究方法在持留菌的研究领域,人们常用抗生素处理稳定期细菌6-8小时来建立持留菌模型。在本研究中,我们用抗生素ofloxacin或者酸性和饥饿的压力条件处理细菌,在抗生素或者压力条件下生存下来的细菌即为持留菌。我们建立了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌持留菌模型,然后从FDA批准的化合物库中筛选针对这些持留菌的药物。最后,将筛选出来的有一定效果的药物在体外进行效果验证,并进一步在动物体内进行药物效果的评价。研究结果我们发现tosufloxacin对金黄色葡萄球菌持留菌具有很好的杀菌作用;tosufloxacin和colistin对大肠埃希菌持留菌具有很好的作用效果;蓖麻油酸钾(potassium ricinoleate)、喹哪啶(quinaldine)、四环素(tetracycline)、硝苯地平(nifedipin)、苏合香脂(storax)和阿西美辛(acemetacin)在和PZA联合应用时,可以明显提高PZA对结核分枝杆菌持留菌的杀菌作用。结论在本研究中我们成功建立了持留菌体外模型,并初步筛选到一些用于治疗持留菌的药物。所筛选的药物有望用于临床细菌感染性疾病的治疗,从而提高该类疾病的治疗效果、缩短治疗疗程和避免疾病的复发。