乳酸菌分泌的细菌素因其安全、无毒且有较强的抑菌活性,能被机体降解,不产生耐药性等优点,被普遍认为是抗生素的有效替代物。牦牛是青藏高原的特有畜种,是当地牧民赖以生存的重要物资,但还未见到对牦牛胃肠道产细菌素乳酸菌分离鉴定的相关报道。本实验的目的是对牦牛肠道产细菌素乳酸菌进行分离鉴定,研究其生物学特性并从分子水平上诠释其益生特性,为进一步开发牦牛专用的微生态制剂奠定基础,取得如下成果:1一株牦牛源产细菌素植物乳杆菌的分离鉴定用含有0.5%碳酸钙MRS固体培养基从19份牦牛粪便样本中分离出91株乳酸菌,采用牛津杯法筛选产细菌素乳酸菌,并利用16S rRNA鉴定。结果表明:在排除有机酸、过氧化氢等干扰因素后,从分离纯化到的91株乳酸菌中筛选到9株对大肠杆菌ATCC25922和金葡球菌ATCC25923仍有明显抑制作用的菌株,并且对蛋白酶敏感,初步认定为产细菌素乳酸菌;经16S rRNA鉴定为4株海氏肠球菌、3株屎肠球菌、1株蒙氏肠球菌、1株植物乳杆菌。鉴于植物乳杆菌抑菌效果最好并且是《饲料添加剂品种目录》和《食品添加剂品种目录》中允许使用的菌种,所以选其为研究对象,命名为植物乳杆菌SWUN5815。进一步的研究表明:该菌株对临床分离的牦牛腹泻病原菌具有很强的广谱抑菌活性;此菌株在pH=2时存活率为58.2%,pH=3时存活率为86.9%,胆盐浓度0.3%时存活率为66.8%,具有良好的耐酸耐胆盐能力;对Caco-2细胞粘附率为42%;对常用的抗生素敏感,不具耐药性。因此,该菌株是一株有潜力的候选益生菌株。2植物乳杆菌SWUN5815株对小鼠增重和肠黏膜免疫的作用40只18 g左右的雌性昆明小鼠分成4组,每组10只。1-3组为实验组,每日分别灌服5×106 CFU、5×107 CFU、5×108 CFU的植物乳杆菌SWUN5815,连续灌胃21 d;4组为对照组,灌服相同体积的MRS肉汤作对照。每7 d称重后每组随机取3只实验组与3只对照组小鼠,刮取小肠黏膜加入等体积的PBS缓冲液(pH=7.4)混匀,以6000×g离心力离心15 min,获得上清液于-20℃保存,用双抗夹心法测定SIgA。结果显示饲喂SWUN5815的各剂量组小鼠平均增重均高于对照组小鼠,其中灌胃5×108CFU的剂量组增重效果极显著高于对照组(P<0.01)。并且SIgA极显著提高(P<0.01)。因此,牦牛源植物乳杆菌SWUN5815能够促进小鼠的生长发育,提高肠粘膜免疫力,可以作为牦牛益生菌的候选菌株。3植物乳杆菌SWUN5815株在小鼠体内拮抗沙门菌的作用研究20只18 g左右的雌性昆明小鼠分成2组,实验组每天饲喂5×108 CFU SWUN5815,对照组饲喂同体积MRS肉汤,连续1周后同时灌胃5×106 CFU鼠伤寒沙门菌,分别于感染48 h、96 h解剖3只小鼠,取肺、脾、肝、十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠,4%多聚甲醛固定后切片,H.E染色,观察组织病理变化;同时以β-actin位内参,荧光定量PCR法检测十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠等组织样本中TNF-α、IFN-γ、1L-1β、1L-6四种炎性细胞因子的变化。结果表明:在感染48 h和96 h,实验组小鼠组织器官的病理变化程度明显轻于对照组;感染后48 h,实验组与对照组相比TNF-α、IFN-γ、1L-1β、1L-6四种细胞因子受到显著抑制,感染96 h后,实验组与对照组相比差异降低。因此SWUN5815具有抑制炎性细胞因子表达,减轻沙门菌引起的肠道病理损伤的作用。4植物乳杆菌SWUN5815株基因组和胞外蛋白组的研究为进一步从分子水平解析其益生性能,采用3代基因测序技术得到SWUN5815株高质量的基因组完成图,并通过质谱技术鉴定了该菌株的胞外蛋白成分。结果显示,该菌株基因组全长3345067 bp,编码3258个基因;18个合成II类细菌素相关基因,因此具有广谱抑菌活性;同时该菌株具有编码Atg22和DUF1440家族蛋白的基因簇,因此具有耐胆盐和耐酸能力;该菌株具有编码Dps家族蛋白的基因簇,能促进宿主的先天性免疫。胞外蛋白鉴定得到85个蛋白,涉及抗菌肽合成、转运、淀粉和蔗糖代谢、双组分系统等代谢通路。本结果从分子水平上解释了植物乳杆菌SWUN5815株的益生特性,为该菌株的进一步开发利用提供了参考。