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小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起,主要发生在山羊、绵羊和野生小反刍动物中的一种急性、烈性、接触性传染病。OIE将小反刍兽疫归为必须上报疫病,我国归为Ⅰ类疫病。目前PPR除在非洲、中东和南亚次大陆传播外,在我国周边地区的许多国家和地区也频繁流行,2007年7月该病首次出现在我国西藏阿里,后又多次小规模爆发。同时,该病作为一种重大的跨国动物疫病,对疾病爆发国家和地区的畜牧业经济造成重大损失,严重影响我国和世界小反刍动物生产和贸易,是我国动物疫病防治和国际动物贸易中检测的重要疫病。本研究利用课题组前期制备的针对小反刍兽疫病毒(Nigeria75/1)核蛋白(N)的杂交瘤细胞,制备单抗腹水,利用亲和层析柱纯化。经间接ELISA测定,效价为1：106。利用PPRV (?)弱毒疫苗免疫山羊,制备PPRV多抗血清并纯化。以纯化的单抗、多抗和已知为PPRV阳性或阴性的细胞培养物建立了PPRV DAS-ELISA检测方法。优化的最终检测程序为：多抗用pH9.6的碳酸盐缓冲液以0.64ng/孔的浓度包被酶标板,37℃作用1h；以0.05%Tween-20PBS溶液为洗板3次；每孔加入50μL待测样品,随后加入50uL浓度为0.385gg/孔的单抗,37℃震荡1h；洗板后,每孔加入100μL1：5000稀释的HRP-羊抗鼠二抗,37℃作用1h；洗板后每孔加入100uLTMB溶液,37℃避光15min；每孔加入100uL2MH2SO4终止,5min内酶标仪450nm读数。抗体的稀释液为0.01M含0.5%BSA,0.05%Tween-20pH7.2的PBS。本研究用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,利用PPRV小鼠单抗和山羊多抗建立了检测PPRV抗原的胶体金层析试纸条。用紫外分光光度法检测,胶体金在524nm处有最大吸收峰,单峰,且峰形窄。优化的试纸条制备程序为：30nm胶体金颗粒；胶体金pH8.2；单抗标记的浓度12μg/ml;单抗标记胶体金时,将单抗逐滴加入胶体金溶液混匀,静置30min,加入0.5%BSA,搅拌15min,再加入0.1%PEG20000,搅拌15min;12000r/min离心45min,弃上清,沉淀用原体积1/10的重悬液重悬,其中重悬液为含1%BSA,10%蔗糖,0.85%NaCl,0.5%Tween-20,0.1M pH8.2的Tris-HCl,重悬后喷在金标垫上；PPRV多抗用含1%NaCl,1%蔗糖,0.5%Tween-200.01M pH8.2的PBS稀释至3mg/ml划在NCM的T线；SPA用去离子水稀释至1mg/ml划在C线；金标垫、样品垫用含1%NaCl,0,5%Tween-20,1%BSA,2%蔗糖的0.1M pH8.2Tris-HCl处理10mmin。综上所述,本研究成功建立了能快速检测PPRV抗原的双抗夹心ELISA和胶体金免疫层析试纸条。此两种方法的建立,与病毒分离和RT-PCR方法相比,缩短了PPRV抗原检测时间、降低了检测成本和检测环境要求,是PPRV检测方法的完善,也是PPR早期诊断和防治的重要工具,有利于基层PPR防控工作的开展。